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Pyroptotic deadly curse of neurons in Alzheimer’s disease : unravelling the role of NLRP3 inflammasome pathway
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Resumo(s)
A doença de Alzheimer é a principal causa de demência e afeta mais de 50 milhões de pessoas em todo o mundo, com tendência crescente devido ao envelhecimento da população. O fenótipo clínico varia entre um estado cognitivamente normal pré-sintomático, embora as alterações patológicas já estejam a decorrer, que progride para um ligeiro prejuízo cognitivo, com algum impacto nas atividades diárias, até se atingir o estadio de demência em que os eventos patológicos já afetam várias áreas corticais. A principal consequência é o declínio progressivo de memória episódica e semântica, tornando o paciente extremamente dependente. Apesar de já ter sido descoberta e diagnosticada à mais de um século por Aloysius Alzheimer em 1907, a doença permanece um mistério complexo e multifatorial sem cura. Os tratamentos atualmente utilizados apenas intervêm nos sintomas e não nos eventos patológicos, procurando reestabelecer o equilíbrio perdido de neurotransmissores, através de inibidores de acetilcolinesterase aumentando a biodisponibilidade de acetilcolina, e de antagonistas de recetores NMDA do glutamato evitando a sua excitotoxicidade. Apesar disso, avanços importantes têm sido feitos nas últimas décadas para compreender a patofisiologia envolvida.
Embora não exista nenhuma teoria aceite que explique a doença de Alzheimer, está claro que existem 2 padrões patológicos persistentes: as placas senis de β-amilóide e os emaranhados neurofibrilares de Tau hiperfosforilada. A proteína β-amilóide acumula-se no espaço extracelular após clivagem da proteína transmembranar precursora de amilóide, enquanto que a Tau, uma proteína associada a microtúbulos, é hiperfosforilada por desequilíbrio entre cinases e fosfatases agregando-se no interior dos neurónios. As consequências neurodegenerativas são evidentes com perda sináptica e morte neuronal. Apesar dessas duas características patológicas serem conhecidas, permanece incerto como ambas estão interligadas e desencadeiam os eventos neurodegenerativos da doença. Por isso, tem sido considerado o envolvimento de um outro participante na doença, a neuroinflamação.
O sistema nervoso central apresenta células intercomunicativas especiais, as células gliais, capazes de reconhecer e reagir rapidamente perante agentes lesivos. São eles a microglia e os astrócitos que participam na remoção desses estímulos nocivos e na recuperação da homeostasia, mecanismo conhecido como neuroinflamação aguda. No entanto, as placas de amilóide e os emaranhados de Tau desencadeiam uma ativação crónica e excessiva destas células com produção exagerada de citocinas pró-inflamatórias que contribuem para a degradação do tecido nervoso. Um dos passos que permite esta neuroinflamação progressiva parece residir na via intracelular do inflamassoma NLRP3. Os inflamassomas são complexos multiproteícos citoplasmáticos que orientam uma resposta imunitária intracelular. O mais conhecido é o inflamassoma NLRP3 (NLRP3) composto por três domínios: o próprio NLRP3 enquanto sensor de uma enorme variedade de padrões moleculares; o adaptador ASC que interliga os domínios; e a proteína efetora pro-Caspase-1. Após reconhecimento do agente nocivo, o complexo NLRP3-ASC-Caspase-1 oligomeriza ficando a Caspase-1 funcional para clivar citocinas pró-inflamatórias e uma proteína recentemente descoberta, a Gasdermin D (GSDMD). Após clivagem, o seu fragmento N-Terminal (GSDMD-NT) é libertado, sendo capaz de se associar e agregar no folheto interno da membrana plasmática. Consequentemente, formam-se poros na membrana que podem desencadear, se não forem corrigidos pelos mecanismos de reparação celular, a piroptose, um tipo de morte celular inflamatória associado a perda do gradiente de concentração celular, rutura membranar e libertação de mediadores inflamatórios. A investigação mais recente mostra evidência sobre a ativação do NLRP3 em células gliais e a piroptose, na presença de oligómeros de β-amilóide (Aβ). No entanto, não há respostas claras quanto ao envolvimento de Tau hiperfosforilada no ambiente neuroinflamatório, a sua relação com a ativação do NLRP3 e a potencial indução de morte neuronal por piroptose.
Com isto em mente, este projeto tem três principais objetivos: 1) estabelecer um modelo ex vivo representativo de doença de Alzheimer que inclua tanto os oligómeros de Aβ como a Tau hiperfosforilada; 2) usar esse modelo para avaliar a morte neuronal por piroptose mediada pela via do inflamassoma NLRP3; e 3) investigar o impacto de inibir o NLRP3 no sistema estabelecido.
Para alcançar tais objetivos, este projeto foi dividido em duas partes. Na primeira parte, foram preparadas fatias agudas de hipocampo de ratos Sprague-Dawley com 7-8 semanas, distribuídas numa placa de incubação e expostas por 4 horas a 200 nM de oligómeros de Aβolig com e sem Ácido Ocadaico (OKA) em três concentrações diferentes (5 nM, 25 nM e 100 nM), resultando em 5 condições (CTL, Aβolig, OKA 5, OKA 25 e OKA 100). Otimizar a concentração de OKA que favorece a fosforilação de Tau, sem provocar excessiva morte celular. Na segunda parte, após ter sido estabelecida a concentração ótima de OKA, reproduziu-se a exposição das fatias agudas de hipocampo a 200 nM de Aβolig com e sem 25 nM de OKA, na presença ou não de 1 μM de MCC950, um inibidor seletivo do NLRP3, resultando assim em 6 condições de estudo (CTL, MCC950, Aβolig, MCC950 + Aβolig, Aβolig + OKA e MCC950 + Aβolig + OKA). Ao longo deste trabalho utilizaram-se as seguintes técnicas experimentais: ensaio de LDH para avaliar morte celular; Western Blot de forma a analisar os níveis proteicos da fosforilação da Tau (Tau normal e hiperfosforilada), dos componentes do inflamassoma (NLRP3, ASC, Caspase-1), da GSDMD e seu domínio ativo (GSDMD-NT) e de marcadores gliais (GFAP, Iba1); Imunohistoquímica que serviu de análise qualitativa da Tau fosforilada, gliose e piroptose neuronal; e finalmente ELISA que permitiu quantificar a secreção de IL-1β.
A combinação mais representativa da doença de Alzheimer consistiu em fatias agudas de hipocampo expostas a 200 nM de Aβolig e 25 nM de OKA. Nesta condição, os níveis proteicos de Tau hiperfosforilada (0.78 ± 0.03) e de GSDMD-NT (0.82 ± 0.06) foram significativamente os mais altos, mesmo quando comparado com o grupo apenas exposto a Aβolig (Tau hiperfosforilada: 0.64 ± 0.03; GSDMD-NT: 0.60 ± 0.05). Adicionalmente, também se originou um aumento de morte celular (18.70 ± 0.93% vs CTL: 13.39 ± 0.91%) característico da doença, embora não excessivo.
Após o modelo ideal ter sido estabelecido, procedeu-se à avaliação da neuroinflamação subjacente. Primeiro, confirmou-se, quer por Western Blot quer por imunohistoquímica, que a fosforilação da Tau induzida nas fatias agudas por Aβolig e mais expressivamente por Aβolig + OKA, foi prevenida na presença de MCC950 (MCC950 + Aβolig: 0.44 ± 0.04; MCC950 + Aβolig + OKA: 0.58 ± 0.08). Segundo, confirmaram-se níveis elevados de GFAP e Iba1 por exposição a Aβolig (GFAP: 0.29 ± 0.02; Iba1: 0.27 ± 0.03) e ainda mais significativamente com Aβolig e OKA (GFAP: 0.40 ± 0.03; Iba1: 0.43 ± 0.05), que foram prevenidos na presença de MCC950, em especial na condição MCC950 + Aβolig + OKA (GFAP: 0.24 ± 0.02; Iba1: 0.22 ± 0.03). De igual forma, os resultados de imunohistoquímica comprovaram ativação microglial e astrogliose nas condições Aβolig e Aβolig + OKA, que foram evitados na presença de MCC950. Terceiro, verificou-se que os níveis dos domínios NLRP3 e ASC não sofreram modificações entre as condições de estudo, mas observou-se que os níveis aumentados de Caspase-1 ativa induzidos por incubação com Aβolig e Aβolig + OKA encontravam-se significativamente reduzidos na presença de MCC950 (Aβolig: 0.40 ± 0.04 vs MCC950 + Aβolig: 0.24 ± 0.02; Aβolig + OKA: 0.41 ± 0.04 vs MCC950 + Aβolig + OKA: 0.16 ± 0.03). Finalmente, determinou-se um aumento significativo de IL-1β (103.08 ± 21.14 ng/mL) e do rácio GSDMD-NT/GSDMD-FL (1.07 ± 0.09) apenas por exposição a Aβolig com OKA, que foram impedidos na presença de MCC950 (IL-1β: 42.14 ± 4.99 ng/mL; rácio GSDMD-NT/GSDMD-FL: 0.46 ± 0.04). Através de imunohistoquímica foi confirmada a localização da GSDMD-NT ao redor dos núcleos dos neurónios sugerindo uma indução de morte neuronal por piroptose, sobretudo na condição Aβolig + OKA e que fora prevenida na presença de MCC950. Este trabalho sugere que Aβ e Tau hiperfosforilada trabalham de forma sinérgica na progressão da neuroinflamação inerente da doença de Alzheimer, provavelmente através da ativação do inflamassoma NLRP3. Mostra igualmente evidências de morte neuronal por piroptose, realçando que os neurónios podem contribuir como instigadores da neuroinflamação. Finalmente, ficou demonstrado que a inibição de NLRP3 previne os eventos patológicos característicos da doença, tratando-se, por isso, de um potencial alvo terapêutico.
Alzheimer’s Disease is a progressive neurodegenerative disorder characterized by extracellular depositions of Amyloid-β and intracellular aggregations of hyperphosphorylated Tau (p-Tau), that affect the major limbic structure, the hippocampus. Recently, neuroinflammation has been associated to AD neuropathologic development with NLRP3 inflammasome (NLRP3), a cytoplasmatic multiprotein complex, as one key player. NLRP3 activation leads to Caspase-1 processing, which in turn, generates the production of pro-inflammatory cytokines and GSDMD-mediated cellular death by pyroptosis. In AD, although glial cells participate in the neuroinflammatory milieu, pyroptotic neuronal death was scarcely explored in AD. This work aimed to explore the pyroptotic neuronal death in an ex vivo model of AD and to investigate the protective effect of NLRP3 inhibition. To accomplish that, acute hippocampal slices were incubated for 4h with Aβ oligomers (Aβolig, 200 nM), Okadaic Acid (OKA, 25 nM),which promotes p-Tau, and both stimuli with MCC950 (1 μM), a selective NLRP3 inhibitor. Protein levels of Tau, gliosis and NLRP3 pathway components were analysed through Western Blot, ELISA and Immunohistochemistry. OKA significantly increased p-Tau, compared to Aβolig exposed slices. Slices subjected to Aβolig and OKA depicted increased gliosis, Caspase-1, cleaved GSDMD and IL-1β upregulation. Under those conditions, was also confirmed Tau phosphorylation, microglia activation an astrogliosis. Furthermore, GSDMD co-localization with a neuronal marker, NeuN, suggested neuronal death by pyroptosis. All these events were prevented by MCC950. This work shows that Aβolig and p-Tau may have a synergistic relationship most likely through NLRP3 pathway overactivation. It provides evidence of neuronal death by pyroptosis, hinting that neurons can also be instigators of neuroinflammation. Finally, NLRP3 inhibition had a significant preventive effect of neuropathological events observed, suggesting this pathway as a potential therapeutic target for AD.
Alzheimer’s Disease is a progressive neurodegenerative disorder characterized by extracellular depositions of Amyloid-β and intracellular aggregations of hyperphosphorylated Tau (p-Tau), that affect the major limbic structure, the hippocampus. Recently, neuroinflammation has been associated to AD neuropathologic development with NLRP3 inflammasome (NLRP3), a cytoplasmatic multiprotein complex, as one key player. NLRP3 activation leads to Caspase-1 processing, which in turn, generates the production of pro-inflammatory cytokines and GSDMD-mediated cellular death by pyroptosis. In AD, although glial cells participate in the neuroinflammatory milieu, pyroptotic neuronal death was scarcely explored in AD. This work aimed to explore the pyroptotic neuronal death in an ex vivo model of AD and to investigate the protective effect of NLRP3 inhibition. To accomplish that, acute hippocampal slices were incubated for 4h with Aβ oligomers (Aβolig, 200 nM), Okadaic Acid (OKA, 25 nM),which promotes p-Tau, and both stimuli with MCC950 (1 μM), a selective NLRP3 inhibitor. Protein levels of Tau, gliosis and NLRP3 pathway components were analysed through Western Blot, ELISA and Immunohistochemistry. OKA significantly increased p-Tau, compared to Aβolig exposed slices. Slices subjected to Aβolig and OKA depicted increased gliosis, Caspase-1, cleaved GSDMD and IL-1β upregulation. Under those conditions, was also confirmed Tau phosphorylation, microglia activation an astrogliosis. Furthermore, GSDMD co-localization with a neuronal marker, NeuN, suggested neuronal death by pyroptosis. All these events were prevented by MCC950. This work shows that Aβolig and p-Tau may have a synergistic relationship most likely through NLRP3 pathway overactivation. It provides evidence of neuronal death by pyroptosis, hinting that neurons can also be instigators of neuroinflammation. Finally, NLRP3 inhibition had a significant preventive effect of neuropathological events observed, suggesting this pathway as a potential therapeutic target for AD.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024
Palavras-chave
Alzheimer’s disease NLRP3 Neuroinflammation Pyroptosis Tau Teses de mestrado - 2024