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Publicação
Evaluation of the morphological and functional properties of erythrocytes in patients with amyotrophic lateral sclerosis
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Autores
Resumo(s)
A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa, fatal e devastadora que se caracteriza pela degeneração progressiva dos neurónios motores situados na espinhal medula, tronco cerebral e córtex motor. A maioria dos doentes com ELA tem entre os 40 e os 60 anos de idade à data do seu diagnóstico. Após o diagnóstico da doença, a esperança média de vida de um doente com ELA é de aproximadamente 3 a 5 anos. A ELA é uma doença complexa devido à sua heterogeneidade e à sua fisiopatologia podendo ser alterada por fatores biológicos. Cerca de 90% dos casos de ELA são considerados esporádicos podendo ter origem, por exemplo, em fatores ambientais ou em disfunções relacionadas com o envelhecimento. Os restantes 10% dos casos de ELA têm um histórico familiar. Relativamente ao fenótipo da doença, a maioria dos casos diagnosticados são considerados de origem espinhal (cerca de 70%). Porém, também existem mais dois fenótipos de ELA menos comuns, o bulbar (representando cerca de 25% dos casos) e o respiratório (cerca de 3%). Atualmente, o diagnóstico é efetuado com base nos critérios El Escorial Revistos, em conjunto com a eletromiografia (Critérios Awaji) para confirmar a extensão da desenervação. Também são realizados testes laboratoriais e exames de imagem para distinguir os doentes ELA de doentes com outras doenças que se possam assemelhar a ELA. Existe também um questionário utilizado a nível mundial, onde a soma das pontuações das respostas origina o valor da escala revista de avaliação funcional da doença (ALSFRS-R). Esta escala visa avaliar o estado funcional global e respiratório do doente e o declínio da doença ao longo do tempo. A escala ALSFRS-R global avalia 12 parâmetros no doente, como por exemplo, a sua função física, a capacidade de engolir, de utilizar utensílios, de subir escadas e a sua função respiratória. O questionário também permite a avaliação da dispneia, ortopneia e a necessidade de suporte ventilatório no doente.
A disfunção respiratória é um fator determinante do comprometimento funcional e morte na ELA. A hipoxia aparece após o enfraquecimento dos músculos respiratórios.
Alterações na estrutura e função dos eritrócitos no fluxo sanguíneo nunca foram descritos na ELA, embora sejam relevantes para uma adequada oxigenação dos tecidos. Existem evidências de que a inflamação está associada à ELA, possivelmente aumentada pelo desconforto respiratório nos doentes. Este fato poderá estar relacionado com o aumento do fibrinogénio plasmático na circulação sanguínea. Níveis aumentados de fibrinogénio plasmático têm sido associados ao aumento da agregação eritrocitária, podendo ter um papel central nos mecanismos que originam eventos trombóticos. A inter-relação entre insuficiência respiratória, inflamação, alterações do fibrinogénio plasmático e da morfologia do eritrócito, com implicações na perfusão periférica, nunca foi explorada na ELA.
O tromboembolismo venoso (TEV) é uma condição médica responsável pela formação de coágulos sanguíneos nas veias. Eventos de TEV foram reportados em alguns casos de doentes com ELA, geralmente associados a fatores como a falta de mobilidade, o envelhecimento e também a insuficiência respiratória. No entanto, alguns fatores de risco associados a TEV ainda não foram devidamente explorados nesta doença.
A formação de coágulos sanguíneos pode dever-se a alterações que ocorrem ao nível da membrana dos eritrócitos (p.ex. alterações da sua elasticidade) que dependem (entre outros fatores) do seu conteúdo lipídico. Em condições inflamatórias, o fibrinogénio ’ (uma variante in vivo do fibrinogénio) está presente no plasma em elevadas concentrações, o que representa um aumento da sua percentagem em relação aos valores totais de fibrinogénio plasmático. Esta variante do fibrinogénio, o fibrinogénio ’, conduz a alterações na arquitetura e na formação de coágulos sanguíneos sendo estes mais resistentes à fibrinólise. Assim, os principais objetivos desta tese consistem em avaliar as alterações morfológicas, biomecânicas e as propriedades biofísicas dos eritrócitos em doentes com ELA. Adicionalmente pretende-se quantificar os níveis de fibrinogénio ’ no plasma sanguíneo, com o intuito de perceber se este marcador de risco inflamatório está alterado na ELA.
No desenvolvimento do trabalho experimental, foram colhidas amostras humanas de sangue provenientes de doentes com ELA que foram analisadas e posteriormente comparadas com um grupo de dadores saudáveis e dadores não saudáveis com outras doenças neurológicas. Numa primeira fase, foram obtidos os hemogramas de todos os pacientes e dadores que participaram neste estudo, e foi efetuada uma avaliação clínica dos dadores não saudáveis e dos doentes com ELA.
As amostras de sangue colhidas foram posteriormente analisadas recorrendo à microscopia de força atómica (AFM) onde foram efetuadas imagens dos eritrócitos, obtidas curvas de elasticidade destas células e foi ainda medida a profundidade a que a ponta do AFM penetra no eritrócito. Com as imagens de AFM foi possível estudar individualmente as características morfológicas do eritrócito nos diferentes grupos de estudo, tais como área, volume, altura, percentagem de eritrócitos sem concavidade, assim como a sua rugosidade de membrana.
Para complementar a análise dos dados obtidos no AFM, foram efetuadas medições do potencial zeta da membrana dos eritrócitos na ausência e na presença de diferentes concentrações de fibrinogénio (0, 0.4, 1.0, 2.0 mg/ml). Foi também realizada a quantificação dos níveis de fibrinogénio ’ no plasma sanguíneo dos diferentes grupos de estudo através de um ensaio imunoenzimático.
Os resultados obtidos sugerem que os eritrócitos de doentes com ELA têm uma área maior e apresentam menor concavidade por comparação com os eritrócitos de dadores saudáveis. A partir das medições do potencial zeta, foi possível verificar que as membranas dos eritrócitos de doentes com ELA apresentam uma carga menos negativa do que o respetivo controlo saudável na presença de elevadas concentrações de fibrinogénio. Para além disso, as membranas dos eritrócitos de doentes com ELA apresentaram um perfil menos rugoso que as dos eritrócitos de controlos saudáveis. Adicionalmente, a profundidade a que a ponta do AFM consegue penetrar é menor em células provenientes de doentes com ELA comparativamente com controlos, podendo se concluir que os eritrócitos de doentes com ELA têm maior rigidez do que os controlos. Por fim, os pacientes com ELA apresentaram concentrações mais elevadas da variante fibrinogénio ’ plasmático em comparação a controlos saudáveis e não saudáveis.
Ao longo deste estudo foram também efetuadas análises de regressão múltipla e análise longitudinal aos parâmetros estudados. A análise de regressão múltipla permite comparar os três grupos para diferentes variáveis de estudo e perceber se os resultados obtidos são ou não influenciados por outras variáveis independentes, tal como a idade e o género. Por outro lado, a análise longitudinal, permitiu fornecer informação relativamente à progressão e agravamento da doença em pacientes com ELA. Os resultados obtidos após a realização da análise longitudinal, revelaram que existem correlações negativas entre a escala ALSFRS-R global e/ou respiratória com a rugosidade dos eritrócitos, a profundidade de penetração nestas células e uma correlação positiva com os níveis plasmáticos de fibrinogénio ’.
Os resultados sugerem que os eritrócitos de pacientes com ELA apresentam alterações eletrostáticas, biomecânicas e morfológicas quando comparados com os controlos saudáveis. Os resultados apontam para um maior risco de inflamação na ELA. Este processo inflamatório parece estar associado a um efeito retardador na progressão da doença.
Estes resultados podem ainda ajudar a compreender, não só o papel do fibrinogénio na agregação eritrocitária, como também as alterações podem ocorrer na membrana dos eritrócitos que comprometem o seu normal funcionamento em doentes com ELA. As alterações
morfológicas dos eritrócitos na ELA poderão contribuir para o início ou agravamento de eventos trombóticos e inflamatórios. O risco de tais eventos trombóticos representa um agravamento do estado de saúde dos indivíduos com ELA que poderá ter impacto na sua mortalidade.
Este estudo foi realizado com um número restrito de doentes. Novos estudos deverão ser efetuados com um grupo mais alargado de doentes de modo a validar os resultados obtidos ao longo desta tese. No entanto, tanto a concentração de fibrinogénio ' plasmático como a rugosidade da superfície da membrana eritrocitária representam dois possíveis biomarcadores da progressão da doença de ELA. Níveis elevados de fibrinogénio ' podem estar associados ao desenvolvimento de processos inflamatórios na ELA. Consequentemente, este processo inflamatório parece estar associado a um processo de diminuição da progressão da doença de ELA (diminuição do declínio da escala funcional global e respiratória).
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a rapidly progressive and fatal neurological disease. Erythrocyte structure and function abnormalities and their role on blood flow never have been described in ALS, although relevant for proper tissue oxygenation. There is large evidence that inflammation is associated with ALS, possibly increased by respiratory distress. This is potentially related to fibrinogen increase in blood circulation. Increased levels of plasma fibrinogen have been associated with the increase of erythrocyte aggregation which may have a central role on the mechanism of thrombosis. The complex interplay between respiratory insufficiency, inflammation, fibrinogen changes and abnormal erythrocyte structure, with implications in peripheral perfusion, has been never explored in ALS. The main purpose of our study was to evaluate changes in morphological, biomechanical, and biophysical properties of erythrocytes from ALS patients and to quantify ’ fibrinogen plasma levels to evaluate if this marker of inflammation is altered in ALS. Blood samples from ALS patients were analysed and compared with healthy donors and non-healthy donors with other neurological diseases. Samples were examined by Atomic Force Microscopy (AFM) to evaluate the changes in morphology and elasticity of erythrocytes, zeta-potential analysis, and quantification of ’ fibrinogen plasma levels. Results showed that erythrocytes from ALS patients have higher area, are less negatively charged and smoother than healthy controls. Also, they presented higher ’ fibrinogen concentrations than controls. A multiple-regression analysis and longitudinal assessment showed negative correlations between ALSFRS global and/or respiratory scores and erythrocyte roughness, erythrocyte penetration depth; and positive correlation with ́ ́fibrinogen plasma levels. The results suggest that erythrocytes from ALS patients present electrostatic, biomechanical, and morphologic changes when compared with healthy control. The results also pointed to a higher risk of inflammation in ALS. This inflammation process seems to be associated to a retarding process in the progression of ALS disease.
Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a rapidly progressive and fatal neurological disease. Erythrocyte structure and function abnormalities and their role on blood flow never have been described in ALS, although relevant for proper tissue oxygenation. There is large evidence that inflammation is associated with ALS, possibly increased by respiratory distress. This is potentially related to fibrinogen increase in blood circulation. Increased levels of plasma fibrinogen have been associated with the increase of erythrocyte aggregation which may have a central role on the mechanism of thrombosis. The complex interplay between respiratory insufficiency, inflammation, fibrinogen changes and abnormal erythrocyte structure, with implications in peripheral perfusion, has been never explored in ALS. The main purpose of our study was to evaluate changes in morphological, biomechanical, and biophysical properties of erythrocytes from ALS patients and to quantify ’ fibrinogen plasma levels to evaluate if this marker of inflammation is altered in ALS. Blood samples from ALS patients were analysed and compared with healthy donors and non-healthy donors with other neurological diseases. Samples were examined by Atomic Force Microscopy (AFM) to evaluate the changes in morphology and elasticity of erythrocytes, zeta-potential analysis, and quantification of ’ fibrinogen plasma levels. Results showed that erythrocytes from ALS patients have higher area, are less negatively charged and smoother than healthy controls. Also, they presented higher ’ fibrinogen concentrations than controls. A multiple-regression analysis and longitudinal assessment showed negative correlations between ALSFRS global and/or respiratory scores and erythrocyte roughness, erythrocyte penetration depth; and positive correlation with ́ ́fibrinogen plasma levels. The results suggest that erythrocytes from ALS patients present electrostatic, biomechanical, and morphologic changes when compared with healthy control. The results also pointed to a higher risk of inflammation in ALS. This inflammation process seems to be associated to a retarding process in the progression of ALS disease.
Descrição
Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022
Palavras-chave
Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) Microscopia de força atómica (AFM) Inflamação Fibrinogénio Eritrócito Teses de mestrado - 2022