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Publicação
Unraveling the antifungal activity of a newly discovered oligomer produced by an in vitro proteolytic pathway
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Orientador(es)
Resumo(s)
Os fungos patogénicos representam, à escala mundial, uma séria ameaça para a saúde humana, tendo-se vindo a registar um aumento significativo de infeções fúngicas devido a fungos patogénicos oportunistas, o que as torna num fator importante de morbidade e mortalidade. Apesar de Candida albicans continuar a liderar as espécies de Candida causadoras de infeções da corrente sanguínea (ICS), nas últimas duas décadas tem ocorrido um desvio epidemiológico para um aumento de espécies de Candida "não-albicans". Infeções causadas por outras espécies de Candida têm vindo a aumentar, sendo responsáveis por mais de 90% das infeções fúngicas invasivas. De entre essas espécies, apenas C. glabrata pode ser verdadeiramente reconhecida como uma espécie emergente causadora de ICS, devido à sua resistência intrínseca e adquirida aos azóis e a outros agentes antifúngicos. Nenhuma das classes de antifúngicos atualmente disponíveis possui todas as características ideais de um agente antifúngico, o que, em última análise, conduz a falhas no tratamento. Como consequência, novas formulações de antifúngicos, combinações terapêuticas e o desenvolvimento de novos compostos bioativos podem ser úteis na obtenção de melhores resultados terapêuticos. As sementes de leguminosas são fontes bastante abundantes de proteínas, sendo o género Lupinus um dos mais ricos neste tipo de proteínas de reserva. As proteínas de reserva das sementes de leguminosas, classificadas como globulinas, compreendem duas famílias principais de proteínas: as vicilinas e as leguminas, que constituem aproximadamente 80% das proteínas totais das suas sementes, atuando não só como reservas de nutrientes durante a germinação, como também como proteínas de defesa para as plantas. A β-conglutina é a principal proteína de reserva nas sementes das espécies de Lupinus, sendo as suas subunidades sintetizadas durante o desenvolvimento cotiledonar de L. albus, a partir de um único polipéptido precursor glicosilado. Após a germinação, as subunidades da β-conglutina sofrem uma grande alteração na sua estrutura e concentração, levando ao aparecimento de um novo conjunto de polipéptidos. Recentemente, foi acidentalmente descoberto no nosso laboratório que a β-conglutina purificada de L. albus sofre, in vitro, um processo de proteólise. Após uma incubação de 7 dias a 25ºC, a β-conglutina sofre uma degradação controlada originando um oligómero estável e com atividade antifúngica, que denominámos PDβ. Tendo em conta o conhecimento prévio da atividade antifúngica do PDβ, este plano de trabalho teve como objetivos principais caracterizar o oligómero e determinar a sua estabilidade e a sua atividade antifúngica, bem como tentar perceber o seu mecanismo de ação como agente antifúngico, avaliando os efeitos fisiológicos e morfológicos em C. glabrata. A primeira fase do trabalho passou por isolar as globulinas totais dos cotilédones de L. albus seguida de purificação da fração correspondente à β-conglutina. Após purificação, a β-conglutina foi incubada a 25°C durante 7 dias, de modo a ocorrer a degradação para PDβ. Começou por se tentar perceber se o resultado desta degradação é devido a uma destruição da estrutura original da proteína dando origem a subunidades independentes. Os resultados permitiram concluir que embora a proteína sofra um processo de degradação, a sua massa molecular aumenta ligeiramente, o que permite concluir que o processo in vitro não se traduz num catabolismo com desaparecimento de sub-unidades mas sim de um arranjo estrutural diferente. O passo seguinte passou por avaliar a evolução do perfil polipeptídico e da atividade antifúngica durante o processo de degradação. Foi possível determinar que a degradação da β-conglutina começa a ocorrer a partir do terceiro dia de incubação a 25°C, sendo o pico máximo de degradação ao fim dos 7 dias. Esta degradação leva a uma acumulação progressiva de um polipéptido com 20 kDa, o que parece semelhante ao catabolismo que ocorre naturalmente nos cotilédones de L. albus. No entanto no processo in vivo a degradação origina exclusivamente um polipéptido de 20 kDa denominado Blad, que acaba por ser completamente degradado. Neste caso, o processo é interrompido sugerindo que falta uma peça chave para posterior degradação. Em relação à atividade antifúngica, o seu aparecimento é gradual: vai aumentando atingindo o pico máximo de atividade aos 7 dias de incubação. De seguida tentou caracterizar-se e identificar o mecanismo envolvido na degradação da β-conglutina em PDβ, começando por se analisar se poderia ser causada por uma reação de oxidação-redução, interferindo com o oxigénio disponível na reação. Os resultados obtidos indicam que o aumento de oxigénio disponível na reação não tem qualquer influência sobre a reação de degradação mas quando se adiciona dithiothreitol (DTT) a degradação não ocorre, ou é interrompida no momento em que este é adicionado. Uma possível explicação pode ser pelo facto de o DTT ser um eficaz desnaturante de proteínas quebrando as ligações dissulfídicas nos grupos de cisteína. Tendo em conta estes resultados e admitindo a hipótese de haver uma protease envolvida no processo de conversão a qual poderia estar a ser inibida por um agente redutor, foram testados vários inibidores de diferentes classes de proteases, adicionando-os separadamente à β-conglutina antes do período de incubação in vitro de 7 dias. Dos inibidores de proteases testados, apenas o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) teve influência na β-conglutina, impedindo a sua degradação. De acordo com este resultado é possível concluir que a degradação da β-conglutina é dependente de uma metaloprotease, inibida aquando da adição de EDTA, resultado confirmado por recurso a uma zimografia. Esta metaloprotease encontra-se sob a forma inativa, encontrando-se apenas ativa ao fim de 3 dias de incubação da β-conglutina a 25°C, altura em que se inicia o processo de degradação. Para esclarecer a origem da molécula responsável pela degradação da β-conglutina, levantou-se a hipótese de se tratar de uma contaminação externa. No entanto, esta hipótese foi abandonada uma vez que tanto a solução de β-conglutina filtrada através de filtros de fluoreto de polivinilideno (PVDF) como a β-conglutina submetida a um tratamento com antibiótico sofreram o processo normal de degradação. Embora nesta fase do trabalho existissem resultados bastante interessantes, nenhum permitiu identificar a molécula responsável pela degradação da β-conglutina. Uma vez que os ensaios de zimografia foram os que permitiram chegar mais perto da sua identidade, foi efetuada uma nova zimografia utilizando as vicilinas totais como substrato, visto ser o substrato natural da metaloprotease em questão. As bandas com atividade proteolítica foram excisadas do gel e enviadas para sequenciação. No entanto, após receção dos resultados verificou-se que não foi possível identificar a possível metaloprotease. Em simultâneo com a caracterização bioquímica do processo de degradação, foi avaliada a atividade antimicrobiana de PDβ, o que revelou que apesar de PDβ não apresentar atividade bactericida, esta apresenta atividade fungicida em várias espécies de leveduras e de fungos filamentosos. Após o rastreio efetuado, foram avaliados os efeitos morfológicos e fisiológicos da PDβ, usando C. glabrata ISA 2163 como modelo. Começou por se comparar a actividade antifúngica de PDβ com a do itraconazole e anfotericina B, o que revelou que PDβ parece apresentar maior atividade inibitória e fungicida numa base molecular do que tanto o itraconazole como a anfotericina B. De seguida, realizaram-se curvas de crescimento de C. glabrata ISA 2163 exposta às concentrações inibitórias e letais de PDβ e de anfotericina B, de modo a estudar e comparar os seus efeitos no crescimento da levedura. As curvas obtidas permitiram concluir que a adição tanto de PDβ como de anfotericina B teve um forte efeito inibitório no crescimento de C. glabrata ISA 2163, visto que as células expostas a ambas as concentrações testadas de ambas as drogas apresentam uma diminuição na taxa de crescimento, quando comparado com a situação controlo (sem droga). Em ambos os casos, os efeitos de inibição começam a ocorrer ao fim de 4 h de incubação, verificando-se uma estabilização da DO640nm e das contagens de unidades formadoras de colónias (UFC), mais acentuada a partir das 12 h de incubação, na fração incubada com a concentração letal de PDβ. Simultaneamente foi avaliado o efeito de PDβ na atividade metabólica, com recurso ao fluorocromo FUN-1, e na integridade da parede celular, com recurso ao calcofluor white, de C. glabrata ISA2163, recolhendo amostras ao longo da curva de crescimento. Os resultados obtidos sugerem que, mesmo ao fim de 24 h de incubação com uma concentração letal de PDβ, não ocorre perda de viabilidade celular sugerindo que as células apenas perdem a capacidade de se multiplicar, dada a estabilização do número de células. Relativamente à integridade da parede celular, existe uma diferença notória entre a fração incubada com PDβ e a fração controlo. Enquanto a integridade da parede celular da fração controlo permanece inalterada ao longo da curva, a fração exposta à PDβ apresenta falhas na marcação com calcofluor white, a partir das 8 h de incubação, tornando-se mais evidentes após as 12 h. Estes resultados sugerem perda de integridade da parede celular e podem ser a razão pela qual as células perdem a capacidade para se multiplicar. Por último, determinou-se a localização celular da PDβ ao fim de 24 h de incubação em C. glabrata ISA 2163. Os resultados obtidos sugerem que PDβ se liga à parede celular da levedura, destabilizando-a. No entanto, não há vestígios da proteína no interior da célula. Este trabalho permite concluir que a degradação in vitro da β-conglutina para PDβ ocorre de forma controlada, possivelmente sob a ação de uma metaloprotease. A atividade desta metaloprotease só é visível após o início da conversão da β-conglutina, aumentando de atividade à medida que o oligómero é convertido. Isto sugere que na semente seca, quando se purifica a β-conglutina, a metaloprotease se encontra inativa, sendo necessária a sua ativação para que a conversão da β-conglutina tenha início. No que respeita a atividade antimicrobiana de PDβ, é possível concluir que a mesma apresenta uma forte atividade em diferentes fungos, tanto leveduras, patogénicas e alimentares, como fungos filamentos. Relativamente ao modo de ação do oligómero, verificou-se que este tem capacidade para se ligar à parede celular da levedura em estudo, criando danos significativos e afetando a sua integridade celular. Os danos causados ao nível da parede celular parecem ser suficientes para impedir a multiplicação do microrganismo, levando à inibição do seu crescimento.
Pathogenic fungi represent, worldwide, a serious threat for human’s health. Candida species are among the top ten pathogens causing bloodstream infections (BSI). C. glabrata can be described as a truly emerging pathogen that cause BSI due, in part, to its intrinsic and acquired resistance to azoles and other commonly used antifungal agents. All antifungal agents available display several disadvantages. It is therefore essential to identify new, potent and safe antifungal drugs with novel modes of action. PDβ is an in vitro breakdown oligomer resultant from the degradation of β-conglutin, with proved antifungal activity. Based on this information and in an attempt to go deeper in knowledge, the first objective of this work was the biochemical characterization of PDβ oligomer and the understanding of the metabolic route involved in the degradation process. This process was found to occur gradually and controlled by a metalloproteinase that needs to be activated, converting an inactive protein into an oligomer with antifungal activity. The second goal was the characterization of PDβ stability and antimicrobial activity against an array of different species. The antimicrobial activity of PDβ was shown to be quite diverse among yeasts and filamentous fungi; however no bactericidal activity was detected. Finally, an attempt to understand PDβ mode of action by assessing its physiological and morphological effects on C. glabrata was explored. Upon exposure of C. glabrata to PDβ, the yeast is still metabolically active but loses its cell wall integrity. Furthermore, the activity of PDβ suggests binding to the cell wall, without entering into the cell. The binding of PDβ leads to damages and destabilization of the cell wall which are severe enough to prevent C. glabrata ISA 2163 multiplication.
Pathogenic fungi represent, worldwide, a serious threat for human’s health. Candida species are among the top ten pathogens causing bloodstream infections (BSI). C. glabrata can be described as a truly emerging pathogen that cause BSI due, in part, to its intrinsic and acquired resistance to azoles and other commonly used antifungal agents. All antifungal agents available display several disadvantages. It is therefore essential to identify new, potent and safe antifungal drugs with novel modes of action. PDβ is an in vitro breakdown oligomer resultant from the degradation of β-conglutin, with proved antifungal activity. Based on this information and in an attempt to go deeper in knowledge, the first objective of this work was the biochemical characterization of PDβ oligomer and the understanding of the metabolic route involved in the degradation process. This process was found to occur gradually and controlled by a metalloproteinase that needs to be activated, converting an inactive protein into an oligomer with antifungal activity. The second goal was the characterization of PDβ stability and antimicrobial activity against an array of different species. The antimicrobial activity of PDβ was shown to be quite diverse among yeasts and filamentous fungi; however no bactericidal activity was detected. Finally, an attempt to understand PDβ mode of action by assessing its physiological and morphological effects on C. glabrata was explored. Upon exposure of C. glabrata to PDβ, the yeast is still metabolically active but loses its cell wall integrity. Furthermore, the activity of PDβ suggests binding to the cell wall, without entering into the cell. The binding of PDβ leads to damages and destabilization of the cell wall which are severe enough to prevent C. glabrata ISA 2163 multiplication.
Descrição
Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
Palavras-chave
PDβ β-conglutina Metaloprotease C. glabrata Agente antifúngico Teses de mestrado - 2015