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RANK pathway mediates a dual response to TRAIL in luminal breast cancer
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Abstract(s)
O cancro da mama é o cancro mais frequente nas mulheres e a principal causa de morte por cancro, tendo sido responsável por 2,3 milhões de novos casos em 2020, representando, assim, 11,7 % dos diagnósticos de cancro globalmente. O cancro da mama é uma doença bastante heterogénea, sendo o subtipo mais comum o Luminal, que apresenta expressão de recetor de estrogénios (RE), recetor de progesterona (RP), ou ambos. Adicionalmente, o cancro da mama Luminal pode ainda ser divido em Luminal A e Luminal B, estando este último associado a uma maior expressão de genes ou proteínas associadas a proliferação (maior expressão de Ki67, por exemplo), ou amplificação do recetor do fator de crescimento epidérmico humano tipo 2 (HER2). A via do recetor ativador do fator nuclear-kB (RANK), principalmente conhecida pelo seu papel na regulação da fisiopatologia óssea, apresenta-se também como um regulador da carcinogénese mamária e progressão tumoral. Desta forma, o bloqueio farmacológico de RANK ligando (RANKL) está a ser estudado independentemente da presença de metástases ósseas, quer a nível preventivo em mulheres portadoras da mutação BCRA1 que apresentam risco aumentado de desenvolver cancro da mama, quer em contexto adjuvante para prevenção de recidiva óssea, onde se observou maior eficácia em combinação com inibidores da aromatase em mulheres pós-menopáusicas. Estudos prévios do nosso laboratório demonstraram que o cancro da mama Luminal com sobre-expressão de RANK (RANK OE) pode desafiar as estratégias terapêuticas atuais, sendo resistente à quimioterapia, terapia endócrina e inibidores das cinases dependentes de ciclina 4 e 6 (CDK4/6). Adicionalmente, resultados preliminares sugerem que a ativação da via RANK ou a sua sobre-expressão levam a um aumento da expressão de recetores do ligando indutor de apoptose relacionado com o fator de necrose tumoral (TRAIL), recetores de morte 4 e 5 (DR4 e DR5), bem como de proteínas inibidoras da apoptose (cIAP1 e 2), sem, no entanto, se observarem alterações significativas na taxa de apoptose in vitro ou in vivo. Com base nestes resultados colocámos a hipótese de que células de cancro da mama Luminal RANK-positivas podem ser resistentes à apoptose induzida por TRAIL, uma caraterística comum das células cancerígenas.As IAPs são proteínas inibidoras das vias das caspases e, por isso, inibem a apoptose. Adicionalmente, são potentes reguladores das vias de sinalização do NF-kB e do recetor do fator de necrose tumoral (TNF), estando frequentemente sobre-expressas em cancro. A expressão de IAPs está associada a um mau prognóstico, dada a sua contribuição para a sobrevivência das células tumorais, quimiorresistência e progressão da doença. Adicionalmente, e paradoxalmente dado que o TRAIL é um potente indutor de apoptose, estudos recentes em diferentes tipos de cancro demonstraram um efeito oposto, nomeadamente proliferação induzida por TRAIL, que pode ser mediada, por exemplo, pelas vias ERK ou PI3K/Akt. Tendo em conta estas evidências, este estudo teve como objetivo investigar o efeito da sobre-expressão de RANK na resistência à apoptose induzida por TRAIL em cancro da mama Luminal, avaliando a eficácia dos antagonistas de IAPs e de inibidores do RANKL para superar essa possível resistência. Para isso, usámos duas linhas celulares humanas de cancro da mama Luminal, MCF-7 e T47D, e os seus derivados RANK OE, previamente gerados e caracterizados pelo nosso Laboratório. Para determinar a resposta intrínseca à apoptose induzida por TRAIL, as células foram mantidas na presença ou ausência de TRAIL recombinante (50, 100, 250 e 500 ng/mL) por diferentes períodos (24, 48 e 72 horas). A viabilidade celular foi avaliada através do ensaio Alamar blue, a proliferação celular através da incorporação de BrdU, e a apoptose através da expressão de anexina V e 7-AAD medida por citometria de fluxo em células tratadas durante 48h com 250 ng/mL de TRAIL. Para avaliar a eficácia terapêutica de um antagonista da cIAP (BV-6) e do bloqueio da via do RANK com um inibidor de RANKL (RANK-Fc) em combinação com o TRAIL, foi quantificada a viabilidade celular de células tratadas durante 48h com 100 ng/mL de BV-6 e/ou de RANK-Fc ± 250 ng/mL de TRAIL, através do ensaio de Alamar blue. Finalmente, para avaliar a ativação da via RANK e a proliferação após estímulo com TRAIL, analisámos a expressão de proteínas a jusante de RANK, bem como do antigénio nuclear de células proliferativas (PCNA) por Western blot, em células parentais e RANK OE estimuladas com 100 ng/mL de TRAIL por diferentes intervalos de tempo. Como esperado, a exposição ao TRAIL diminuiu a viabilidade celular de células com níveis fisiológicos de RANK, mas não de células RANK OE, onde não só se observou resistência ao TRAIL, como também um aumento da proliferação celular, mais evidente após 48 horas de tratamento com 250 ng/mL e 500ng/mL de TRAIL. Esta observação foi confirmada pela quantificação da incorporação de BrdU, e complementada pela avaliação da apoptose induzida por TRAIL, com as células parentais MCF-7 a apresentarem uma resposta apoptótica significativamente mais elevada após o tratamento com TRAIL e as células MCF-7 RANK OE a apresentarem uma resposta negligenciável (tanto na apoptose precoce como na tardia). Estes resultados suportam a hipótese de que a sobre-expressão de RANK diminui a sensibilidade à apoptose induzida pelo TRAIL em linhas celulares de cancro da mama Luminal. No entanto, apesar de estudos anteriores em diversos tipos de cancro sugerirem a implicação das vias ERK ou PI3K/Akt na resistência à apoptose induzida por TRAIL, não observámos diferenças na expressão destas proteínas, motivo pelo qual será importante realizar estudos adicionais neste sentido. Relativamente ao potencial do bloqueio da via RANK e utilização de antagonistas da cIAP para sensibilizar células RANK OE à apoptose induzida por TRAIL, nenhum dos compostos (BV-6 ou RANK-Fc) em monoterapia afetou significativamente a viabilidade celular na presença de TRAIL, sugerindo que a resistência à apoptose induzida pelo TRAIL é independente das cIAP. No entanto, a terapia combinada (BV-6 + RANNK-Fc) inibiu a proliferação induzida por TRAIL nas células RANK OE, sugerindo uma possível ligação entre as cIAPs e a proliferação mediada por TRAIL observada nestas células. Em suma, utilizando uma abordagem in vitro, confirmámos que a sobre-expressão de RANK induz resistência intrínseca à apoptose induzida pelo TRAIL, que parece ser independente das cIAP. Por outro lado, o TRAIL é indutor da proliferação em linhas celulares RANK OE, que pode ser impedida com recurso a antagonistas das cIAP em combinação com inibidores do RANKL. O cancro da mama Luminal com sobre-expressão de RANK representa um desafio terapêutico, e a inibição farmacológica da via RANK é um tema de particular relevância. Dados pré-clínicos sugerem que a quimioterapia, terapia endócrina e inibidores de CDK4/6 serão menos eficazes neste subgrupo de doentes, devido às alterações moleculares que ocorrem concomitantemente com a sobre-expressão de RANK. Sendo a resistência à apoptose induzida pelo TRAIL outra característica de tumores RANK OE, serão necessários estudos complementares de forma a explorar novas formas induzir apoptose, tendo como objetivo final melhorar os resultados daquela que é uma das patologias mais relevantes atualmente.
The receptor activator of nuclear factor kB (RANK) pathway is a major regulator of several pathophysiological processes and is implicated in mammary gland development and carcinogenesis. Our recent studies have shown that RANK overexpression (OE) is associated with an aggressive phenotype in Luminal breast cancer (BC), including resistance to chemo and endocrine therapy and CDK4/6 inhibitors. Preliminary results from our group have also shown that RANK OE and RANK ligand (RANKL)- pathway activation leads to the up-regulation of tumor necrosis factor- related apoptosisinducing ligand (TRAIL) receptors and inhibitor of apoptosis proteins (cIAP1 and 2). However, an increase in apoptotic rate was not observed, suggesting resistance to TRAIL-induced apoptosis. Taking this into account, this work aimed to determine the effect of RANK OE in TRAIL-induced apoptosis in Luminal BC and assess the efficacy of cIAP antagonists and RANK-pathway blockade to overcome such resistance. The intrinsic sensitivity to TRAIL-induced apoptosis was assessed in vitro by quantifying cell viability, proliferation, and apoptosis of MCF-7 and T47D Luminal BC cell lines exposed to TRAIL, as well as of their RANK OE derivatives. Cell viability assays were conducted to assess the efficacy of cIAP antagonists (BV-6) and RANK-pathway blockade (RANK-Fc) in combination with TRAIL. Results show that RANK OE was associated with resistance to TRAIL-induced apoptosis; and an increase in proliferation was observed in cells exposed to TRAIL. The single use of BV-6 or RANK-Fc did not affected the viability rate, independently of RANK, suggesting a cIAP-independent mechanism. Nevertheless, the combination therapy rescued TRAILinduced proliferation in RANK OE cells, which may indicate that TRAIL-mediated proliferation is cIAP-related. Overall, we could confirm that RANK OE induces not only intrinsic resistance to TRAILinduced apoptosis, but also proliferation although this is probably cIAP-independent. It will be important to assess in the future how RANK OE cells can be sensitized to TRAILinduced apoptosis, as well as characterize the mechanism involved.
The receptor activator of nuclear factor kB (RANK) pathway is a major regulator of several pathophysiological processes and is implicated in mammary gland development and carcinogenesis. Our recent studies have shown that RANK overexpression (OE) is associated with an aggressive phenotype in Luminal breast cancer (BC), including resistance to chemo and endocrine therapy and CDK4/6 inhibitors. Preliminary results from our group have also shown that RANK OE and RANK ligand (RANKL)- pathway activation leads to the up-regulation of tumor necrosis factor- related apoptosisinducing ligand (TRAIL) receptors and inhibitor of apoptosis proteins (cIAP1 and 2). However, an increase in apoptotic rate was not observed, suggesting resistance to TRAIL-induced apoptosis. Taking this into account, this work aimed to determine the effect of RANK OE in TRAIL-induced apoptosis in Luminal BC and assess the efficacy of cIAP antagonists and RANK-pathway blockade to overcome such resistance. The intrinsic sensitivity to TRAIL-induced apoptosis was assessed in vitro by quantifying cell viability, proliferation, and apoptosis of MCF-7 and T47D Luminal BC cell lines exposed to TRAIL, as well as of their RANK OE derivatives. Cell viability assays were conducted to assess the efficacy of cIAP antagonists (BV-6) and RANK-pathway blockade (RANK-Fc) in combination with TRAIL. Results show that RANK OE was associated with resistance to TRAIL-induced apoptosis; and an increase in proliferation was observed in cells exposed to TRAIL. The single use of BV-6 or RANK-Fc did not affected the viability rate, independently of RANK, suggesting a cIAP-independent mechanism. Nevertheless, the combination therapy rescued TRAILinduced proliferation in RANK OE cells, which may indicate that TRAIL-mediated proliferation is cIAP-related. Overall, we could confirm that RANK OE induces not only intrinsic resistance to TRAILinduced apoptosis, but also proliferation although this is probably cIAP-independent. It will be important to assess in the future how RANK OE cells can be sensitized to TRAILinduced apoptosis, as well as characterize the mechanism involved.
Description
Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2024
Keywords
Cancro da mama luminal Recetor ativador do fator nuclear ƙB (RANK) Ligando indutor de apoptose relacionado com o fator de necrose tumoral (TRAIL) Proteínas inibidoras da apoptose (IAPs)