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Publicação
Identification of metabolites by liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometric technique
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Resumo(s)
Analytical methods based on mass spectrometry and coupled to a chromatographic separation technique such as HPLC or GC, are crucial for investigating human metabolome, UPLC coupled with ESI-MS is a recent methodology representing an effective tool to separate and analyze molecules.
The mains focus of this experimental work was to elucidate the influence of HILIC and Reversed-Phase chromatography on the analysis of compounds through ESI-MS. One additional aim was also to collect the identification data of selected compounds on a database for the building of a metabolomics library. This tool would allow to establish a match with results of subsequent analyses, minimizing the time spent on the identification of future analytes.
Herein a UHPLC–MS method was applied for the first time to detect and identify a series of human metabolites and compounds found naturally on the human body. The procedures and molecules subjected to analysis are based on the protocol “Mass Spectrometry Metabolite Library of Standards”, commercially available by IROA Technologies. The kit contains a set of 619 standards. This work covers the first 253 compounds of the list.
The analysis of compounds previously prepared as mixtures consisted on the chromatographic separation by HILIC or RP followed by positive or negative ESI-MS/MS. All the compounds were analyzed by the four possible combinations (HILIC, positive ESI; HILIC, negative ESI; RP, positive ESI; RP, negative ESI) as mixes of 12 standards distributed by four vials, one for each type of analysis.
The results obtained were compiled and it was possible to conclude that HILIC is suitable to polar analytes whereas RP is preferable to non-polar compounds. Relatively to ESI, the positive ionization mode is applied with advantage to compounds that are able to accept a proton. Conversely, negative ESI is more effective to molecules which contain functional groups that readily lose a proton. Zwitterionic molecules are suitable to be analyzed by both modes. Some examples and exceptions to these general statements are presented.
Os métodos analíticos baseados em espectrometria de massa e acoplados a uma técnica de separação cromatográfica como HPLC ou GC, são cruciais para investigar o metaboloma humano. A análise por UPLC acoplada a ESI-MS é uma metodologia recente que representa uma ferramenta eficaz para separar e analisar moléculas. O foco principal deste trabalho experimental foi elucidar a influência de HILIC e cromatografia em fase reversa na análise de compostos através de ESI-MS. Um objectivo adicional foi também recolher os dados de identificação de compostos seleccionados numa base de dados para a construção de uma biblioteca de metabolitos. Esta ferramenta permitiria estabelecer uma correspondência com resultados de análises subsequentes, minimizando o tempo gasto na identificação de futuros analitos. Neste projecto, o método de análise por UHPLC-MS foi aplicado pela primeira vez para detectar e identificar uma série de metabolitos humanos e compostos encontrados naturalmente no corpo humano. Os procedimentos e moléculas submetidos à análise são baseados no protocolo "Mass spectrometry Metabolite Library of Standards", comercialmente disponível pela IROA Technologies. O kit contém um conjunto de 619 padrões. Este trabalho abrange os primeiros 253 compostos da lista. A análise de compostos previamente preparados em misturas consistiu na separação cromatográfica por HILIC ou RP seguida por ESI-MS/MS positiva ou negativa. Todos os compostos foram analisados pelas quatro combinações possíveis (HILIC, ESI positivo/ HILIC, ESI negativo/ RP, ESI positivo/ RP, ESI negativo) como misturas de 12 padrões distribuídos por quatro frascos, um para cada tipo de análise. Os resultados obtidos foram compilados e foi possível concluir que a separação por HILIC é adequada para analitos polares, enquanto que por RP é preferível para compostos não polares. Relativamente à ionização por ESI, o modo de ionização positiva melhor aplicado a compostos capazes de aceitar um protão. Por outro lado, a ESI negativa é mais eficaz para moléculas que contêm grupos funcionais que facilmente perdem um protão. As moléculas zwitteriónicas são passíveis de ser analisadas por ambos os modos. Alguns exemplos e excepções a estas ideias gerais são apresentadas.
Os métodos analíticos baseados em espectrometria de massa e acoplados a uma técnica de separação cromatográfica como HPLC ou GC, são cruciais para investigar o metaboloma humano. A análise por UPLC acoplada a ESI-MS é uma metodologia recente que representa uma ferramenta eficaz para separar e analisar moléculas. O foco principal deste trabalho experimental foi elucidar a influência de HILIC e cromatografia em fase reversa na análise de compostos através de ESI-MS. Um objectivo adicional foi também recolher os dados de identificação de compostos seleccionados numa base de dados para a construção de uma biblioteca de metabolitos. Esta ferramenta permitiria estabelecer uma correspondência com resultados de análises subsequentes, minimizando o tempo gasto na identificação de futuros analitos. Neste projecto, o método de análise por UHPLC-MS foi aplicado pela primeira vez para detectar e identificar uma série de metabolitos humanos e compostos encontrados naturalmente no corpo humano. Os procedimentos e moléculas submetidos à análise são baseados no protocolo "Mass spectrometry Metabolite Library of Standards", comercialmente disponível pela IROA Technologies. O kit contém um conjunto de 619 padrões. Este trabalho abrange os primeiros 253 compostos da lista. A análise de compostos previamente preparados em misturas consistiu na separação cromatográfica por HILIC ou RP seguida por ESI-MS/MS positiva ou negativa. Todos os compostos foram analisados pelas quatro combinações possíveis (HILIC, ESI positivo/ HILIC, ESI negativo/ RP, ESI positivo/ RP, ESI negativo) como misturas de 12 padrões distribuídos por quatro frascos, um para cada tipo de análise. Os resultados obtidos foram compilados e foi possível concluir que a separação por HILIC é adequada para analitos polares, enquanto que por RP é preferível para compostos não polares. Relativamente à ionização por ESI, o modo de ionização positiva melhor aplicado a compostos capazes de aceitar um protão. Por outro lado, a ESI negativa é mais eficaz para moléculas que contêm grupos funcionais que facilmente perdem um protão. As moléculas zwitteriónicas são passíveis de ser analisadas por ambos os modos. Alguns exemplos e excepções a estas ideias gerais são apresentadas.
Descrição
Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016
Palavras-chave
Hydrophilic interaction liquid chromatography Electrospray ionization Mass spectrometry Reversed phase Library Metabolites Mestrado Integrado - 2016