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Publicação
Regeneration dynamics of the radial nerve cord in the sea star Marthasterias glacialis (Linnaeus, 1758)
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Orientador(es)
Resumo(s)
A regeneração é um processo conservativo de desenvolvimento pós-embrionário que ocorre nas
células somáticas e sucede em indivíduos no estado larval, jovens e adultos. Envolve a reparação e
reposição de células, tecidos e órgãos, ou até mesmo a substituição de partes corporais inteiras com a
mesma estrutura, forma e polaridade. Este mecanismo é despoletado após uma lesão traumática ou
amputação devido a predação, ou quando o próprio organismo realiza autotomia como mecanismo de
defesa à predação ou como mecanismo de reprodução assexuada. No entanto, a capacidade de
regeneração é diversa para as várias espécies. Em particular, os mamíferos apresentam uma ineficiente
regeneração ao nível do Sistema Nervoso Central (SNC) após lesão traumática, o que resulta na perda
ou deficiências de atividade motora. Por outro lado, a regeneração do SNC, assim como a regeneração
de outros tecidos, órgãos e membros corporais, tem elevada expressão nos equinodermes. Tornando-se
por isso, fundamental estudar o processo de regeneração nos equinodermes, com o objetivo de
compreender a evolução e os mecanismos do SNC nos humanos, assim como perceber as causas deste
processo não estar ativo em certos sistemas anatómicos, apresentando-se as estrelas-do-mar como
relevante modelo de estudo. Nestes organismos a regeneração pós-traumática e pós-autotomia do braço
tem sido recorrentemente alvo de investigação, ao passo que a regeneração do SNC não tem colhido
tanto interesse pela comunidade científica. Por estes motivos, este projeto destinou-se a estudar a fase
inicial do processo de regeneração pós-traumática do Cordão Nervoso Radial (RNC) da estrela-do-mar
da espécie Marthasterias glacialis. Esta espécie, denominada comumente como estrela-do-mar de
espinhos derivado do seu corpo ser coberto por espinhos, detém de uma extraordinária capacidade para
regenerar partes do corpo, possui o RNC numa posição anatómica exterior e apresenta uma elevada
abundância nas praias da costa portuguesa, sendo por isso largamente utilizada como organismo modelo
nos estudos de regeneração. Desta forma, com o objetivo de investigar os processos celulares e
moleculares que lhe estão associados foi estudada a histologia do tecido nervoso em regeneração e as
dinâmicas das populações celulares e das proteínas circulantes no fluído celómico. O processo
regenerativo desencadeado pela amputação de uma porção do RNC na parte distal da ponta do braço da
estrela-do-mar foi estudado em três pontos-temporais (1 dia, 7 dias e 14 dias após excisão parcial do
nervo). Relativamente ao estudo das proteínas solubilizadas no fluído celómico livre de células (CFF),
foi efetuada a sua quantificação total pelo método espectrofotométrico de BCA depois de removida a
porção celular do fluído celómico (celomócitos). Verificaram-se diferenças significativas na quantidade
de proteína total no CFF entre o dia 1 pós-amputação do nervo (p.a.) e o dia 14 p.a., e entre todos os
pontos temporais e o grupo controlo. No entanto, foram também encontradas diferenças significativas
em amostras de CFF de animais controlo recolhidas em dias diferentes. O que implicará a realização de
novos ensaios usando grupos controlo para cada dia de recolha de fluído coelómico. Para o estudo das
populações celulares circulantes no fluído celómico, foi usada marcação com DRAQ5 de forma a
caracterizar as células vivas, e obter valores de side scatter, forward scatter, incorporação de DRAQ5 e
determinar a percentagem de eventos celulares por citometria de fluxo (CF). Com base em ensaios de
CF tinham sido descritas em Andrade et al. (2021), duas populações celulares em animais não
amputados (P1 e P2). P2 apresentou valores de incorporação de DRAQ5 e de side scatter superiores aos
valores medidos para P1. As mesmas duas populações foram observadas no grupo controlo usado neste
estudo. Verificou-se que as percentagens de eventos celulares para estas duas populações não
apresentam diferenças significativas durante o processo de regeneração. No entanto, destaca-se a
observação de uma nova população de celomócitos, aqui designada P3. Esta população surge na maioria
das amostras a partir do dia 7 p.a. e ganha maior evidência no dia 14 p.a. Em concordância, foram
registadas diferenças significativas na sua abundância entre o grupo controlo e os dias 7 e 14 p.a, e entre o dia 1 p.a e os dias 7 e 14 p.a. Esta população celular (P3) apresenta valores de side scatter que podem
ser associados à medição da sua complexidade morfológica, similares aos das células da população P1.
Enquanto os níveis de incorporação de DRAQ5 da população P3 são similares aos da população P2. O
estudo morfológico dos padrões tecidulares e celulares do nervo em regeneração foi efetuado através de
técnicas histológicas, com recurso ao método de coloração tricromática e visualização dos tecidos por
microscopia ótica. Nesta análise evidencia-se uma rápida regeneração do tecido nervoso amputado e
uma mudança gradual na sua conformação ao longo do tempo de regeneração. No dia 1 p.a ainda não é
possível visualizar a reposição da ligação do cordão nervoso no local onde ocorreu a sua excisão parcial.
No dia 7 p.a. já é possível verificar a existência de tecido nervoso a ligar as duas extremidades
lesionadas, porém com reduzida espessura, especialmente na zona do neuropilo. No dia 14 p.a este
tecido em regeneração apresenta maior espessura com dimensões e estrutura semelhantes ao tecido
original. Com a particularidade de presumivelmente a zona somática do epitélio ectoneural, que é
constituída pelos corpos celulares dos neurónios e das células gliais radiais, ser a primeira a ser
regenerada, só depois seguida pela zona do neuropilo. Em concordância com o processo morfaláctico,
verifica-se ainda hipertrofia do seio hiponeural, do canal vascular aquífero e do canal hemal,
possivelmente em consequência do fluxo de fatores moleculares e/ou a migração de células que poderão
coadjuvar no processo regenerativo. Adicionalmente, também é possível visualizar nos três pontos temporais a retração dos pés ambulacrários na região de amputação do nervo, presumivelmente como
mecanismo comportamental de defesa e de proteção da região lesionada.
Previamente à realização dos ensaios acima descritos, e com o propósito de controlar a
variabilidade biológica encontrada em estudos anteriores, avaliou-se um conjunto de parâmetros de fácil
determinação sem recurso a processos invasivos que permitissem distinguir entre machos e fêmeas. A
sua futura utilização iria permitir separar os animais em função do género e, consequentemente a
realização dos ensaios de regeneração para cada um dos géneros, anulando a eventual contribuição deste
fator nestes estudos. De modo a cumprir este objetivo, as estrelas-do-mar foram caracterizadas através
de medidas biométricas tais como, o diâmetro do disco central, o peso, o comprimento e a largura dos
braços, assim como as razões entre cada uma destas medidas. Foi ainda determinada a quantidade total
de proteína no CFF e avaliada a sua correlação com as medidas biométricas. Concluiu-se que estes
parâmetros não permitem criar um modelo preditivo do sexo de novos espécimes, não tendo sido
possível fazer a separação dos animais em função do género nos ensaios de regeneração descritos.
Apesar de não ter sido possível concluir sobre a influência do sexo na regeneração devido ao reduzido
poder estatístico, os resultados obtidos não sugerem que esta seja a causa das diferenças encontradas
nestes estudos.
Por fim, foi também realizada a distinção com base em parâmetros morfológicos e pelas
determinações efetuadas por citometria de fluxo de imagem (CFI) das subpopulações de celomócitos de
cada uma das duas populações anteriormente caracterizadas em Andrade et al. (2021). As imagens
obtidas por CFI foram associadas a três subpopulações da população P1, uma subpopulação a mais do
que tinha sido caracterizado anteriormente, e aqui designada como P1B, e a 4 subpopulações da
população P2. Cada par de subpopulações entre cada população foi sujeito a um algoritmo de
inteligência artificial, a partir do qual obteve-se os parâmetros que permitem uma melhor discriminação.
Onde, consequentemente, foi possível obter uma boa distinção entre cada par das três subpopulações da
P1 através de parâmetros de textura, e das quatro subpopulações da P4 em termos de textura, forma ou
tamanho celular. Estes parâmetros serão usados em futuros estudos das dinâmicas das células circulantes
após a indução de regeneração.
Mammals show inefficient regeneration at the level of the Central Nervous System (CNS) posteriorly to the traumatic lesion, which results in loss or disabilities of motor activity. However, the regeneration of the CNS in deuterostomes has its maximum expression in echinoderms. Therefore, it is essential to study the regenerative process in echinoderms to understand their differential mechanisms in humans. This project aimed to study the post-traumatic Radial Nerve Cord (RNC) regeneration of the starfish Marthasterias glacialis at 1, 7, and 14 days after partial nerve excision, through the characterization of the coelomic fluid cellular populations (coelomocytes) by flow cytometry (FC), the cellular processes and patterns of the nerve tissue through histology tools and the determination of the total protein in the cell-free celomic fluid (CFF). A new population of coelomocytes was identified by FC at 7 days post-amputation (p.a.) and its presence reinforcement at 14 days p.a., suggesting its involvement in the regeneration process. Histological analysis showed a rapid regeneration of the amputated nervous tissue, resembling the non-regenerating tissue at 14 p.a. On day 7 p.a. the RNC injured ends are connected by nerve tissue consisting of the hyaline layer, the somatic zone, and the hyponeural epithelia, although with a neuropile thin layer. Additionally, a hypertrophy of the coelomic canals is accentuated proposing an increment of molecules and/or cells migration. In accordance, CFF total protein shows an augmentation trend from day 1 to 14 p.a. To reduce eventual biological variability due to gender a biometric study was performed. It was concluded that M. glacialis specimens do not have external sexual dimorphism hampering a regeneration study specific for each gender. Finally, a distinction between coelomocytes subpopulations was successfully made based on optical and morphological parameters by image flow cytometry (IFC) through an artificially intelligence algorithm.
Mammals show inefficient regeneration at the level of the Central Nervous System (CNS) posteriorly to the traumatic lesion, which results in loss or disabilities of motor activity. However, the regeneration of the CNS in deuterostomes has its maximum expression in echinoderms. Therefore, it is essential to study the regenerative process in echinoderms to understand their differential mechanisms in humans. This project aimed to study the post-traumatic Radial Nerve Cord (RNC) regeneration of the starfish Marthasterias glacialis at 1, 7, and 14 days after partial nerve excision, through the characterization of the coelomic fluid cellular populations (coelomocytes) by flow cytometry (FC), the cellular processes and patterns of the nerve tissue through histology tools and the determination of the total protein in the cell-free celomic fluid (CFF). A new population of coelomocytes was identified by FC at 7 days post-amputation (p.a.) and its presence reinforcement at 14 days p.a., suggesting its involvement in the regeneration process. Histological analysis showed a rapid regeneration of the amputated nervous tissue, resembling the non-regenerating tissue at 14 p.a. On day 7 p.a. the RNC injured ends are connected by nerve tissue consisting of the hyaline layer, the somatic zone, and the hyponeural epithelia, although with a neuropile thin layer. Additionally, a hypertrophy of the coelomic canals is accentuated proposing an increment of molecules and/or cells migration. In accordance, CFF total protein shows an augmentation trend from day 1 to 14 p.a. To reduce eventual biological variability due to gender a biometric study was performed. It was concluded that M. glacialis specimens do not have external sexual dimorphism hampering a regeneration study specific for each gender. Finally, a distinction between coelomocytes subpopulations was successfully made based on optical and morphological parameters by image flow cytometry (IFC) through an artificially intelligence algorithm.
Descrição
Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Palavras-chave
Regeneração pós-traumática do cordão nervoso radial Fluído celómico Celomócitos Quantidade total de proteína Teses de mestrado - 2022