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Publicação
New roles of deacetylase inhibitors in the modulation of mitochondrial amino acid oxidation and nitrogen metabolism
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Resumo(s)
Mitochondrial dysfunction may be caused by several biochemical mechanisms and is potentially associated with certain drugs such as specific protein lysine deacetylase inhibitors (KDACi). Post-translational modifications (PTMs) of proteins like lysine acetylation (Ack) are regulatory events that affect the flux of several metabolic pathways, namely amino acid oxidative metabolism, fatty acid oxidation (FAO) and urea cycle (UC). Key intermediates (referred to as “linchpin molecules”) are regulators of the activity of the enzymatic effectors (acetyltransferases and deacetylases) of these PTMs. These molecules provide signals for organism adaptation to stress stimuli such as caloric intake decrease, disease, and xenobiotics (e.g. KDACi). KDACi are being investigated in clinical trials for treatment of cancer or other pathologies. The antiepileptic drug valproic acid (VPA), a short-branched chain fatty acid and KDACi, has long been recognized as an inducer of mitochondrial dysfunction, underlying a potential adverse hepatotoxicity. These effects have been associated with altered mitochondrial pathways including FAO and UC, and the mechanisms involved are not fully understood. The clarification of the influence of selected KDACi including VPA on linchpin molecules and protein lysine acetylation is the main objective of the research work presented herein. To address this general aim, experimental studies were designed to evaluate the effects of VPA on the hepatic profile of lysine acetylated proteins (acetylome) as well as on the homeostasis of NAD+, a regulator of the acetylome. Targeted analyses of intermediary metabolites and the activity of certain enzymes of pathways known to be affected by altered protein acetylation profiles (FAO and UC) were undertaken. To evaluate if common core mechanisms underly KDACi function and related metabolic effects, experiments were also performed with suberoyl-bis-hydroxamic acid (SBHA), a structurally different KDACi. The experimental procedures conducted to clarify the hypotheses under study included in vivo and in vitro drug-treated models as well as metabolomic and proteomic analysis of different biological specimens derived from these models. Metabolite profiling in human plasma, rat plasma and liver, and HepaRG cells revealed an alteration of certain amino acids in association with VPA (human, rat and HepaRG), and SBHA (only HepaRG) exposure. KDACi administration induced the accumulation of branched-chain amino acids, lysine, glycine and other precursors of hepatic NAD+ biosynthesis in plasma and liver (tissue and cells), as well as plasma depletion of tryptophan. These alterations prompted the hypothesis of a potential disruption of the homeostasis of the cofactor NAD+. Mass-spectrometry based methods enabled the characterization of the hepatic NAD+ metabolome, allowing the identification of a depletion of this cofactor in rat liver following the first acute administration of VPA, but not after repeated exposure to the drug. Studies on NAD+ levels using HepaRG cells incubated with VPA and SBHA revealed a similar response. These data (in human, rat and liver cells) support the idea that KDACi administration is associated with immediate lowered hepatic NAD+ abundance and amino acid metabolism disruption. Considering that important NAD+-dependent deacetylases are located in mitochondria, further studies aimed at the assessment of the acetylation status of proteins in sub-cellular fractions isolated from rat liver during VPA administration. The characterization of protein lysine acetylation status in liver homogenate, as well as nuclear and mitochondrial protein extracts, was achieved using mono-dimensional (1D) and two-dimensional (2D) poly-acrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed an increase in mitochondrial lysine acetylation during sub-chronic drug treatment, as well as an altered histone acetylation levels at the onset and after repeated drug administration. The crude identification of proteins by 2D-SDS-PAGE suggested that proteins involved in FAO and UC could be significantly affected by the increase in protein acetylation levels. These pathways have been previously shown to be critically regulated by the acetylation status of their enzymes. The possible consequences of the dysregulation of lysine acetylation and NAD+ homeostasis during VPA administration was evaluated by functional studies that mainly involved the mitochondrial pathways FAO and UC. To characterize FAO homeostasis, free fatty acids (FFA) were analyzed in plasma of rats subjected to two VPA administration regimens, further identified and quantified through SID-GC-MS. The accumulation of certain FFAs, namely dicarboxylic and hydroxylated FFAs, provided evidence of a potential inhibition of specific enzymes involved in FAO, some of which are known to be regulated by protein lysine acetylation. To characterize UC homeostasis, further functional studies involved the determination of the activity of the UC enzymes carbamoyl-phosphate synthetase (CPS I), ornithine transcarbamylase (OTC), argininosuccinate lyase (ASL) and arginase (ARG). Enzymatic assays were developed for the characterization of UC enzymes activity in human liver versus HepaRG cells cultured in monolayer and three-dimensional (3D, bioartificial liver) devices. Decreased specific activities of CPS I, OTC and ARG were obtained in HepaRG cells, possibly underlying the decreased UC function of these cells. Furthermore, a decrease in the specific activity of CPS I and OTC was confirmed during acute and repeated administration of VPA, respectively. Overall, the studies presented in this thesis suggest the dysregulation of the hepatic NAD+ metabolome and of the status of mitochondrial protein lysine acetylation as novel roles of certain KDACi, namely VPA, with functional consequences on downstream targets of amino acid or fatty acid oxidation and urea cycle pathways. The pleiotropic effects of VPA administration that affect several metabolic pathways, may contribute to explain the related hepatotoxic effects. The imbalance of these key biochemical cofactors and pathways may be a common core mechanism of KDACi activity, as shown by the similar metabolic effects of VPA and SBHA, and may also underlie the anticancer effects of these molecules.
A disfunção mitocondrial pode ser consequência de uma desregulação de diversas vias metabólicas. Este desequilíbrio pode ser provocado por vários fatores, incluindo deficiências genéticas endógenas (mutações ou deleções parciais de cromossomas ou alterações no DNA mitocondrial) ou por indutores exógenos, como os xenobióticos. Neste grupo, tomam-se os efeitos dos inibidores de desacetilases de resíduos lisina em proteínas (KDACi) como modelos e objeto do presente estudo. Estes fármacos possuem atividade reconhecida na modulação de enzimas que catalisam determinadas modificações pós-tradução (PTMs), nomeadamente a acetilação de resíduos lisina em proteínas (AcK). Esta variante específica de PTM é um dos mais relevantes processos de regulação da atividade enzimática, especificamente em vias metabólicas maioritariamente mitocondriais como a oxidação de aminoácidos e de ácidos gordos (FAO) e o ciclo da ureia. Pequenas moléculas ou metabolitos intermediários que regulam a atividade de enzimas que por sua vez modulam estas PTMs são designados como “moléculas charneira”. Estas moléculas providenciam sinais metabólicos que têm como fim a adaptação do organismo a estímulos como a diminuição da ingestão calórica, patologias, ou exposição a moléculas exógenas ou xenobióticos (ex: fármacos KDACi). Vários KDACi estão atualmente sob investigação no contexto de ensaios clínicos para o tratamento de cancro e outras patologias. Um exemplo de KDACi potencialmente associado a disfunção mitocondrial como mecanismo subjacente a uma indesejada hepatotoxicidade é o ácido valpróico (VPA), também caracterizado como fármaco antiepiléptico e anticonvulsivante. Têm sido identificadas interações cruciais entre este ácido gordo ramificado de cadeia curta e vias metabólicas mitocondriais, nomeadamente a FAO e o ciclo da ureia. No entanto, a ligação entre estes efeitos do VPA, a sua ação sobre os alvos KDAC e os mecanismos envolvidos não estão totalmente esclarecidos. O principal objetivo dos estudos apresentados nesta dissertação é contribuir para o conhecimento das consequências de certos KDACi, incluindo o VPA, sobre a homeostase de moléculas charneira e a sua influência sobre vias metabólicas reguladas por AcK. As hipóteses formuladas durante o trabalho experimental pretenderam clarificar os efeitos do VPA nos perfis hepáticos de AcK e investigar as consequências da administração deste fármaco na homeostase do cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como regulador das enzimas moduladoras de AcK. Para esclarecer os potenciais efeitos da disrupção destes mecanismos regulatórios/cofactores foram avaliadas vias reconhecidamente reguladas pelos mecanismos/cofactores mencionados. Para avaliar a potencial existência de mecanismos comuns atribuíveis à desregulação metabólica por KDACi, foi também testado um segundo KDACi, neste caso da família dos derivados do ácido hidroxâmico, o ácido suberoil-bis-hidroxâmico (SBHA). Os procedimentos experimentais orientados pelas questões iniciais incluíram a utilização de modelos farmacológicos in vivo e in vitro e o recurso a métodos instrumentais baseados em espectrometria de massa para a avaliação dirigida de perfis metabólicos e proteómicos de diversos espécimes biológicos. A caracterização de grupos de metabolitos em plasma humano, plasma e fígado de rato, e na linha celular HepaRG (derivada de hepatoma humano) revelou alterações nos perfis de determinados aminoácidos associados à exposição a VPA (humanos, ratos e HepaRG) e SBHA (apenas HepaRG). A administração destes KDACi promoveu a acumulação de aminoácidos de cadeia ramificada (leucina e isoleucina), lisina, glicina e de precursores hepáticos das vias de biossíntese do NAD+, bem como a diminuição dos níveis plasmáticos de triptofano. Em conjunto, estas modificações metabólicas levantaram a hipótese de uma potencial alteração nos níveis hepáticos do cofactor NAD+. A caracterização dos níveis hepáticos desta “molécula charneira” implicou o prévio desenvolvimento de novos métodos quantitativos baseados na separação por cromatografia líquida e deteção por espectrometria de massa em tandem (UPLC-MS/MS). Foi identificada uma depleção significativa de NAD+ em fígado de rato no início da administração de VPA (1 hora após a toma) e uma aparente normalização dos níveis deste cofactor após exposição repetida ao fármaco (toma diária durante 15 dias). Incubação de células HepaRG com VPA e SBHA demonstrou uma resposta similar com depleção inicial nos níveis celulares de NAD+. Os resultados obtidos nos diferentes modelos biológicos já mencionados (humano, rato e células hepáticas), reforçam a ideia de que a administração de KDACi está associada a uma diminuição imediata na abundância hepática de NAD+, em conjunto com uma disrupção do metabolismo hepático de determinados aminoácidos. A desregulação dos níveis hepáticos deste cofactor está também associada a alterações nos níveis de AcK de diversas proteínas histónicas e não histónicas, embora no primeiro caso possa constituir um efeito previsível pela ação intrínseca dos KDACi. Para esclarecer esta questão, e considerando que as principais desacetilases localizadas na mitocôndria são dependentes de NAD+, foram avaliados os perfis de AcK de proteínas em homogeneizados totais de fígado de rato bem como nas respectivas frações subcelulares. Analisaram-se extratos mitocondriais e nucleares através de protocolos de separação proteica mono- (1D) e bi-dimensionais (2D) por electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Observou-se um aumento significativo nos níveis de acetilação de lisinas em proteínas mitocondriais após administração repetida de VPA, bem como alterações significativas nos níveis de acetilação de lisinas específicas em histonas nucleares (H3K9 ou H3K27) no início e após administração repetida de VPA. A separação de proteínas mitocondriais por 2D-SDS-PAGE permitiu também uma identificação preliminar das proteínas hiperacetiladas após exposição ao fármaco. Nesse sentido, evidenciaram-se as proteínas incluídas em vias como a FAO e o ciclo da ureia, cuja atividade catalítica é reconhecidamente regulada pelo estado de acetilação. Para elucidar as possíveis consequências da híper- ou hipoacetilação de enzimas bem como da depleção de NAD+ associadas ao tratamento com o fármaco procedeu-se a uma análise funcional de vias reguladas por ambos os fatores, designadamente as vias mitocondriais FAO e UC. A caracterização da FAO prosseguiu com a quantificação de ácidos gordos livres (AGL) analisados por SID-GC-MS em plasmas de rato sob administração de dois regimes de VPA. Estes estudos demonstraram a acumulação de determinados AGL dicarboxílicos e AGL hidroxilados em relação aos animais controlo, que sugere uma inibição de enzimas mitocondriais possivelmente modificadas no estado de acetilação. A caracterização do ciclo da ureia incluiu a determinação da atividade específica das enzimas carbamoil-fosfato sintetase (CPS I), ornitina transcarbamilase (OTC), argininosuccinato liase (ASL) e arginase (ARG). Para este efeito foram desenvolvidos e optimizados novos ensaios enzimáticos em fígado humano e em culturas celulares em monocamada e em modelos tridimensionais (3D, fígado bioartificial) da linha HepaRG. A diminuição significativa da atividade específica das enzimas CPS I, OTC e ARG em células HepaRG (tanto em culturas monocamada como em 3D) quando comparadas com fígado humano pode ser um fator subjacente ao acentuado decréscimo na função do ciclo da ureia nesta linha celular. Para além do modelo celular humano derivado de hepatoma também se determinaram as atividades das enzimas mitocondriais CPS I e OTC em fígado de rato após a administração de VPA. Os resultados obtidos demonstraram uma diminuição significativa da atividade específica da CPS I (no ínicio da terapêutica com o fármaco) e da OTC (após regime de administração sub-crónico) Globalmente, os resultados apresentados nos capítulos experimentais que constituem esta tese demonstram a desregulação dos níveis hepáticos de NAD+ e da acetilação de resíduos lisina de proteínas mitocondriais como evidenciam novas ações ao nível sub-celular associadas aos KDACi em estudo, nomeadamente do VPA. Estas alterações podem ter eventuais consequências funcionais em alvos de vias metabólicas como a oxidação de aminoácidos ou de ácidos gordos (FAO) e o ciclo da ureia (UC). Os efeitos pleiotrópicos da administração de VPA, interferindo com diversos compartimentos subcelulares e envolvendo várias vias metabólicas, contribuem para elucidar os mecanismos inerentes aos efeitos deste fármaco, potencialmente hepatotóxicos. A alteração nos níveis de compostos “charneira” e da homeostase de vias metabólicas chave podem ser efeitos subjacentes à atividade dos KDACi, como demonstrado pelos efeitos metabólicos comuns a VPA e SBHA, e podem igualmente ser relevantes para a atividade anticancerígena destas moléculas.
A disfunção mitocondrial pode ser consequência de uma desregulação de diversas vias metabólicas. Este desequilíbrio pode ser provocado por vários fatores, incluindo deficiências genéticas endógenas (mutações ou deleções parciais de cromossomas ou alterações no DNA mitocondrial) ou por indutores exógenos, como os xenobióticos. Neste grupo, tomam-se os efeitos dos inibidores de desacetilases de resíduos lisina em proteínas (KDACi) como modelos e objeto do presente estudo. Estes fármacos possuem atividade reconhecida na modulação de enzimas que catalisam determinadas modificações pós-tradução (PTMs), nomeadamente a acetilação de resíduos lisina em proteínas (AcK). Esta variante específica de PTM é um dos mais relevantes processos de regulação da atividade enzimática, especificamente em vias metabólicas maioritariamente mitocondriais como a oxidação de aminoácidos e de ácidos gordos (FAO) e o ciclo da ureia. Pequenas moléculas ou metabolitos intermediários que regulam a atividade de enzimas que por sua vez modulam estas PTMs são designados como “moléculas charneira”. Estas moléculas providenciam sinais metabólicos que têm como fim a adaptação do organismo a estímulos como a diminuição da ingestão calórica, patologias, ou exposição a moléculas exógenas ou xenobióticos (ex: fármacos KDACi). Vários KDACi estão atualmente sob investigação no contexto de ensaios clínicos para o tratamento de cancro e outras patologias. Um exemplo de KDACi potencialmente associado a disfunção mitocondrial como mecanismo subjacente a uma indesejada hepatotoxicidade é o ácido valpróico (VPA), também caracterizado como fármaco antiepiléptico e anticonvulsivante. Têm sido identificadas interações cruciais entre este ácido gordo ramificado de cadeia curta e vias metabólicas mitocondriais, nomeadamente a FAO e o ciclo da ureia. No entanto, a ligação entre estes efeitos do VPA, a sua ação sobre os alvos KDAC e os mecanismos envolvidos não estão totalmente esclarecidos. O principal objetivo dos estudos apresentados nesta dissertação é contribuir para o conhecimento das consequências de certos KDACi, incluindo o VPA, sobre a homeostase de moléculas charneira e a sua influência sobre vias metabólicas reguladas por AcK. As hipóteses formuladas durante o trabalho experimental pretenderam clarificar os efeitos do VPA nos perfis hepáticos de AcK e investigar as consequências da administração deste fármaco na homeostase do cofactor nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) como regulador das enzimas moduladoras de AcK. Para esclarecer os potenciais efeitos da disrupção destes mecanismos regulatórios/cofactores foram avaliadas vias reconhecidamente reguladas pelos mecanismos/cofactores mencionados. Para avaliar a potencial existência de mecanismos comuns atribuíveis à desregulação metabólica por KDACi, foi também testado um segundo KDACi, neste caso da família dos derivados do ácido hidroxâmico, o ácido suberoil-bis-hidroxâmico (SBHA). Os procedimentos experimentais orientados pelas questões iniciais incluíram a utilização de modelos farmacológicos in vivo e in vitro e o recurso a métodos instrumentais baseados em espectrometria de massa para a avaliação dirigida de perfis metabólicos e proteómicos de diversos espécimes biológicos. A caracterização de grupos de metabolitos em plasma humano, plasma e fígado de rato, e na linha celular HepaRG (derivada de hepatoma humano) revelou alterações nos perfis de determinados aminoácidos associados à exposição a VPA (humanos, ratos e HepaRG) e SBHA (apenas HepaRG). A administração destes KDACi promoveu a acumulação de aminoácidos de cadeia ramificada (leucina e isoleucina), lisina, glicina e de precursores hepáticos das vias de biossíntese do NAD+, bem como a diminuição dos níveis plasmáticos de triptofano. Em conjunto, estas modificações metabólicas levantaram a hipótese de uma potencial alteração nos níveis hepáticos do cofactor NAD+. A caracterização dos níveis hepáticos desta “molécula charneira” implicou o prévio desenvolvimento de novos métodos quantitativos baseados na separação por cromatografia líquida e deteção por espectrometria de massa em tandem (UPLC-MS/MS). Foi identificada uma depleção significativa de NAD+ em fígado de rato no início da administração de VPA (1 hora após a toma) e uma aparente normalização dos níveis deste cofactor após exposição repetida ao fármaco (toma diária durante 15 dias). Incubação de células HepaRG com VPA e SBHA demonstrou uma resposta similar com depleção inicial nos níveis celulares de NAD+. Os resultados obtidos nos diferentes modelos biológicos já mencionados (humano, rato e células hepáticas), reforçam a ideia de que a administração de KDACi está associada a uma diminuição imediata na abundância hepática de NAD+, em conjunto com uma disrupção do metabolismo hepático de determinados aminoácidos. A desregulação dos níveis hepáticos deste cofactor está também associada a alterações nos níveis de AcK de diversas proteínas histónicas e não histónicas, embora no primeiro caso possa constituir um efeito previsível pela ação intrínseca dos KDACi. Para esclarecer esta questão, e considerando que as principais desacetilases localizadas na mitocôndria são dependentes de NAD+, foram avaliados os perfis de AcK de proteínas em homogeneizados totais de fígado de rato bem como nas respectivas frações subcelulares. Analisaram-se extratos mitocondriais e nucleares através de protocolos de separação proteica mono- (1D) e bi-dimensionais (2D) por electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Observou-se um aumento significativo nos níveis de acetilação de lisinas em proteínas mitocondriais após administração repetida de VPA, bem como alterações significativas nos níveis de acetilação de lisinas específicas em histonas nucleares (H3K9 ou H3K27) no início e após administração repetida de VPA. A separação de proteínas mitocondriais por 2D-SDS-PAGE permitiu também uma identificação preliminar das proteínas hiperacetiladas após exposição ao fármaco. Nesse sentido, evidenciaram-se as proteínas incluídas em vias como a FAO e o ciclo da ureia, cuja atividade catalítica é reconhecidamente regulada pelo estado de acetilação. Para elucidar as possíveis consequências da híper- ou hipoacetilação de enzimas bem como da depleção de NAD+ associadas ao tratamento com o fármaco procedeu-se a uma análise funcional de vias reguladas por ambos os fatores, designadamente as vias mitocondriais FAO e UC. A caracterização da FAO prosseguiu com a quantificação de ácidos gordos livres (AGL) analisados por SID-GC-MS em plasmas de rato sob administração de dois regimes de VPA. Estes estudos demonstraram a acumulação de determinados AGL dicarboxílicos e AGL hidroxilados em relação aos animais controlo, que sugere uma inibição de enzimas mitocondriais possivelmente modificadas no estado de acetilação. A caracterização do ciclo da ureia incluiu a determinação da atividade específica das enzimas carbamoil-fosfato sintetase (CPS I), ornitina transcarbamilase (OTC), argininosuccinato liase (ASL) e arginase (ARG). Para este efeito foram desenvolvidos e optimizados novos ensaios enzimáticos em fígado humano e em culturas celulares em monocamada e em modelos tridimensionais (3D, fígado bioartificial) da linha HepaRG. A diminuição significativa da atividade específica das enzimas CPS I, OTC e ARG em células HepaRG (tanto em culturas monocamada como em 3D) quando comparadas com fígado humano pode ser um fator subjacente ao acentuado decréscimo na função do ciclo da ureia nesta linha celular. Para além do modelo celular humano derivado de hepatoma também se determinaram as atividades das enzimas mitocondriais CPS I e OTC em fígado de rato após a administração de VPA. Os resultados obtidos demonstraram uma diminuição significativa da atividade específica da CPS I (no ínicio da terapêutica com o fármaco) e da OTC (após regime de administração sub-crónico) Globalmente, os resultados apresentados nos capítulos experimentais que constituem esta tese demonstram a desregulação dos níveis hepáticos de NAD+ e da acetilação de resíduos lisina de proteínas mitocondriais como evidenciam novas ações ao nível sub-celular associadas aos KDACi em estudo, nomeadamente do VPA. Estas alterações podem ter eventuais consequências funcionais em alvos de vias metabólicas como a oxidação de aminoácidos ou de ácidos gordos (FAO) e o ciclo da ureia (UC). Os efeitos pleiotrópicos da administração de VPA, interferindo com diversos compartimentos subcelulares e envolvendo várias vias metabólicas, contribuem para elucidar os mecanismos inerentes aos efeitos deste fármaco, potencialmente hepatotóxicos. A alteração nos níveis de compostos “charneira” e da homeostase de vias metabólicas chave podem ser efeitos subjacentes à atividade dos KDACi, como demonstrado pelos efeitos metabólicos comuns a VPA e SBHA, e podem igualmente ser relevantes para a atividade anticancerígena destas moléculas.
Descrição
Tese de doutoramento, Farmácia (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
Palavras-chave
Teses de doutoramento - 2017