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Identification and characterization of Internal Ribosome Entry Sites (IRES) in cancer pathways
Publication . Neves, Ana Rita Rodrigues; Loison, Luísa Romão,1963-; Candeias, Marco Marques
Em eucariotas, a informação genética está codificada na molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid), sendo transcrita para ácido ribonucleico mensageiro prematuro (pre-mRNA, do inglês premature ribonucleic acid), num processo denominado transcrição, e posteriormente traduzida para proteína, num processo designado tradução. Durante a transcrição, a molécula de pre-mRNA sofre um processo de maturação durante o qual lhe são adicionadas uma estrutura cap (guanina metilada, m7G) na extremidade 5’, e uma cadeia de poliadenosinas [cauda poli(A)] na extremidade 3’, e num fenómeno designado por splicing, se dá a remoção das regiões não codificantes (intrões) que intercalam com regiões codificantes/regulatórias (exões), e a junção das últimas. Seguidamente, o mRNA maduro é translocado para o citoplasma onde é traduzido para proteína nos ribossomas. A tradução implica, normalmente, o reconhecimento da estrutura cap por factores de iniciação da tradução (eIF, do inglês eukaryotic translation initiation factor). Após este reconhecimento, o complexo de preiniciação da tradução 43 S (43S PIC, do inglês 43S preinitiation complex), que depende da formação prévia do complexo ternário [factor eucariótico de iniciação da tradução 2 (eIF2, do inglês eukaryotic translation initiation factor 2) ligado a uma guanosina trifosfato (GTP, do inglês guanosine triphosphate) e à molécula de RNA de transferência (tRNA, do inglês transfer ribonucleic acid) que transporta a primeira metionina da cadeia peptídica (Met-tRNAi, do inglês initiator tRNA methionine complex)], é recrutado para a extremidade 5’ do mRNA, de onde iniciará o rastreamento da região 5’ transcrita mas não traduzida do mRNA (5’UTR, do inglês 5’untranslated region), até que este reconheça um codão de iniciação num contexto favorável. Quando um codão de iniciação é reconhecido, inicia-se a fase de alogamento da tradução, que consiste na síntese de uma cadeia peptídica. A terminação da tradução ocorre quando um codão stop é reconhecido pelo ribossoma, o que conduz à dissociação da recentemente formada cadeia peptídica do ribossoma e à reciclagem deste. Em condições de stresse, as células reduzem globalmente a síntese proteica sobretudo através da inibição da iniciação canónica da tradução. Esta inibição pode ser mediada, entre outras vias, pela fosforilação da subunidade alfa (α) do eIF2 (eIF2α), impedindo a sua reciclagem que é necessária para a formação de um novo complexo ternário, e consequentemente, do 43S PIC. A fosforilação do eIF2α é mediada por diferentes cinases em resposta a diferentes estímulos, designadamente stresse do retículo endoplasmático (RE), escassez de nutrientes e danos no DNA. Contudo, proteínas associadas à resposta ao stresse podem continuar a ser traduzidas usando mecanismos alternativos, permitindo às células redireccionar os seus esforços para combater o stresse. Algumas dessas proteínas são codificadas por mRNA que contêm regiões estruturadas designadas por locais de entrada internos do ribossoma (IRES, do inglês internal ribosome entry sites), que recrutam o ribossoma internamente para a vizinhança de codões de iniciação. A iniciação da tradução através destas estruturas requer muitas vezes a interacção com proteínas específicas, ITAF (do inglês, IRES trans-acting factor), e elimina a necessidade de reconhecimento da estrutura cap. A transformação de células normais em células tumorais ocorre devido a um acumular de mutações que conduz à inactivação ou à ativação de proteínas, ou ainda à alteração da sua actividade biológica. Muitas das proteínas que se encontram alteradas em cancro regulam vias essenciais ao crescimento e desenvolvimento de uma célula, e estão também associadas a programas de resposta ao stresse. Deste modo, e como seria expectável, são muitas as proteínas associadas ao cancro, cujos mRNA contêm IRES, permitindo, deste modo, a sua expressão em condições em que a tradução canónica está inibida. Este mecanismo de protecção celular, é explorado por células tumorais, que estão muitas vezes sujeitas a condições de stresse (escassez de oxigénio, escassez de nutrientes, ou danos no DNA), de forma a aumentar a sua capacidade de sobrevivência e proliferação. Este projecto teve por objectivo o estudo da expressão mediada por IRES de isoformas de proteínas que se encontram alteradas em diversos tipos de cancro: a isoforma Δ160p53 do supressor de tumores p53, que parece apresentar funções oncogénicas previamente associadas a mutações missense no gene TP53; e uma isoforma ainda não descrita do GTPase H-Ras, p14H-Ras, cuja expressão parece ser induzida em condições de stresse do RE a um nível bastante superior em relação à expressão da isoforma canónica do H-Ras (p21H-Ras). Recorrendo a uma análise in silico da estabilidade da região com possível actividade de IRES para cada um dos alvos, e de acordo com o conteúdo em GC e a energia mínima livre de Gibbs previstos, concluímos que ambos se tratavam de bons candidatos. Adicionalmente, pretendíamos avaliar o efeito de mutações associadas ao desenvolvimento de cancro no funcionamento deste mecanismo alternativo. Desta forma, usámos um vector bicistrónico que contém, como cistrão a 5’, a região codificante da luciferase da medusa Renilla reniformis (Rluc, do inglês Renilla luciferase), e, como cistrão a 3’, a região codificante da luciferase do pirilampo Photynus pyralis (Fluc, do inglês firefly luciferase). Deste modo, analisámos a expressão de cada uma das proteínas através da respectiva actividade de luciferase por medição directa da luminescência resultante de cada uma das reacções com o respectivo substrato. Este vector bicistrónico contém um hairpin (estrutura em grampo) estável a jusante do codão stop da Rluc, para impedir que o ribossoma reinicie a tradução após terminação da tradução canónica da Rluc, de maneira que a tradução da Fluc ocorrerá de forma independente da estrutura cap, e apenas na presença de estruturas no mRNA localizadas na vizinhança do respectivo codão de iniciação que permitam o recrutamento interno do ribossoma. As sequências em estudo para a actividade de IRES foram inseridas imediatamente a montante do codão de iniciação da Fluc e as mutações estudadas foram inseridas nesses mesmos constructos por mutagénese dirigida. A actividade de IRES foi estudada na ausência e na presença de thapsigargina, uma droga inibidora da bomba de cálcio do RE, que induz o stresse deste organelo, promovendo assim a inibição da tradução canónica por fosforilação do eIF2α. Relativamente ao estudo da expressão mediada por IRES do Δ160p53, observações anteriores indicaram que Δ160p53 contém um IRES nos primeiros 432 nucleótidos (nt) codificantes da isoforma Δ160p53, e que parte da região codificante de outra isoforma do p53, Δ133p53, localizada a montante do correspondente codão de iniciação do Δ160p53 (5’UTR do Δ160p53), inibe a actividade de IRES. Usando o sistema bicistrónico descrito anteriormente, analisámos a actividade de IRES dos 432 nt do Δ160p53 e a sua inibição por parte da respectiva 5’UTR. No constructo bicistrónico que contém os 432 nt do Δ160p53 observámos um aumento (não estatisticamente significativo) na actividade de luciferase da Fluc, e que, na presença da 5’UTR, esta é inibida. Além disso, analisámos o efeito de três das mutações missense mais comuns do TP53 (R175H, R248Q e R273H) na actividade de IRES. De acordo com os nossos resultados, as mutações R248Q e R273H parecem induzir a actividade do IRES em condições de stresse do RE. Portanto, a função oncogénica destas mutações poderá estar relacionada com o aumento da expressão dependente de IRES do Δ160p53 em tecidos tumorais, promovendo a capacidade de proliferação, sobrevivência e invasão das células. Além de identificar IRES, pretendíamos caracterizá-los a nível da estrutura e da regulação. Deste modo, iniciámos o processo de optimização da caracterização in vivo da estrutura secundária do IRES do Δ160p53 através do método de modificação química de ácidos nucleicos usando o dimetilsulfato (DMS), bem como das condições de imunoprecipitação do Hdm2 (do inglês murine double minute 2 human homolog)⸺foi descrito como ITAF capaz de regular a expressão dependente de IRES do XIAP (do inglês X-linked inhibitor of apoptosis protein) e cuja interação com um IRES presente no mRNA do p53 foi observada⸺para identificar novos IRES regulados por esta ITAF através da sequenciação de RNA previamente co-immunoprecipitados usando anticorpos anti-Hdm2. Em diferentes condições de stresse, foi observado recentemente no nosso laboratório o aumento da expressão de uma isoforma ainda não descrita do GTPase H-Ras, p14H-Ras, indicando que um mecanismo de tradução alternativo poderá regular a sua expressão. Além disso, observou-se também que a presença da mutação silenciosa H27H (T81>C), associada a um maior risco de desenvolvimento de cancro, promovia o aumento da expressão de p14H-Ras em condições de stresse. Usando o mesmo sistema bicistrónico, analisámos a actividade de IRES de 195 nt da região codificante do p21H-Ras (região codificante limitada pelo codão de iniciação do p21H-Ras e pelo hipotético codão de initiação do p14H-Ras). Além disso, analisámos o efeito na actividade deste hipotético IRES da mutação silenciosa T81>C. Os nossos resultados sugerem que, em condições de stresse, esta região é capaz de mediar a tradução de forma independente da estrutura cap e que a mutação estimula a actividade de IRES. Um possível papel oncogénico desta mutação será promover a expressão desta isoforma, que, tal como Δ160p53, poderá apresentar funções oncogénicas. No futuro, pretendemos realizar um rastreio de drogas capazes de inibir a actividade dos IRES aqui estudados, e avaliar se estas poderão reverter o processo de tumorigénese. Além disso, pretendemos caracterizar a estrutura secundária de cada um destes IRES, identificar novos IRES e novas ITAF. Pretendemos, assim, identificar proteínas cuja expressão através de IRES possa estar implicada no desenvolvimento de cancro, e assim fornecer novas abordagens para a terapia desta doença.
Fluoxetine Arrests Growth of the Model Diatom Phaeodactylum tricornutum by Increasing Oxidative Stress and Altering Energetic and Lipid Metabolism
Publication . Feijão, Eduardo; Cruz de Carvalho, Ricardo; Duarte, Irina A.; Matos, Ana Rita; Cabrita, Maria Teresa; Novais, Sara C.; Lemos, Marco F. L.; Caçador, Isabel; Marques, João Carlos; Reis-Santos, Patrick; Fonseca, Vanessa F.; Duarte, Bernardo
Pharmaceutical residues impose a new and emerging threat to aquatic environments and its biota. One of the most commonly prescribed pharmaceuticals is the antidepressant fluoxetine, a selective serotonin re-uptake inhibitor that has been frequently detected, in concentrations up to 40 μg L-1, in aquatic ecosystems. The present study aims to investigate the ecotoxicity of fluoxetine at environmentally relevant concentrations (0.3, 0.6, 20, 40, and 80 μg L-1) on cell energy and lipid metabolism, as well as oxidative stress biomarkers in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. Exposure to higher concentrations of fluoxetine negatively affected cell density and photosynthesis through a decrease in the active PSII reaction centers. Stress response mechanisms, like β-carotene (β-car) production and antioxidant enzymes [superoxide dismutase (SOD) and ascorbate peroxidase (APX)] up-regulation were triggered, likely as a positive feedback mechanism toward formation of fluoxetine-induced reactive oxygen species. Lipid peroxidation products increased greatly at the highest fluoxetine concentration whereas no variation in the relative amounts of long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) was observed. However, monogalactosyldiacylglycerol-characteristic fatty acids such as C16:2 and C16:3 increased, suggesting an interaction between light harvesting pigments, lipid environment, and photosynthesis stabilization. Using a canonical multivariate analysis, it was possible to evaluate the efficiency of the application of bio-optical and biochemical techniques as potential fluoxetine exposure biomarkers in P. tricornutum. An overall classification efficiency to the different levels of fluoxetine exposure of 61.1 and 88.9% were obtained for bio-optical and fatty acids profiles, respectively, with different resolution degrees highlighting these parameters as potential efficient biomarkers. Additionally, the negative impact of this pharmaceutical molecule on the primary productivity is also evident alongside with an increase in respiratory oxygen consumption. From the ecological point of view, reduction in diatom biomass due to continued exposure to fluoxetine may severely impact estuarine and coastal trophic webs, by both a reduction in oxygen primary productivity and reduced availability of key fatty acids to the dependent heterotrophic upper levels.
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