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Development of new drug leads for tuberculosis

Publication . Campaniço, André Filipe da Silva; Lopes, Francisca Conceição; Moreira, Rui Ferreira Alves; Warner, Digby Francis

Tuberculosis (TB) is a deadly disease caused by a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The complexity and duration of the treatment lead to misuse and low compliance by patients, increasing disease burden and the appearance of multidrug-resistant strains of M. tuberculosis. Thus, new antibiotics active against drug-resistant M. tuberculosis and useful for short period therapeutic regimens at lower required doses are urgently needed. A family of azaaurone-based derivatives, from a chemical library developed in iMed.ULisboa, revealed to be active against M. tuberculosis, including multidrug- and extensively drug-resistant clinical isolates, at a submicromolar level. [3] Despite the promising activities, this new scaffold displayed poor ADME properties. In this thesis, we report the complete SAR exploration and ADME profiling of newly synthesized derivatives. All chemical sites of the azaaurone scaffold were extensively explored. More metabolically stable moieties were introduced, generating compounds with improved in vitro half-lives. More hydrophilic groups were inserted and nonaromatic heterocycles were introduced to disrupt the scaffold planarity, two strategies to improve overall solubility. The double bond within the scaffold was also reduced to a single bond, generating a new family of saturated analogues of azaaurones. The new synthesized derivatives displayed improved potency against M. tuberculosis and retained its activity on drug-resistant isolates, remaining non-cytotoxic and selective for the bacteria. Identification of the target was attempted through isolation of resistant mutants, but it was not successful as no azaaurone-resistant isolates were found. Final azaaurones are typically obtained as mixtures of E/Z isomers. The isomers were isolated and differentially studied. Both display similar antitubercular activity. Furthermore, azaaurone isomers were found to isomerize in the presence of mouse liver microsomes (MLM) and under the influence of light. Concerning photoisomerization, it was concluded that this family of azaaurones does not display the optimal characteristics to be used as a photoswitch system.

2022-05Doctoral thesis

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Smart hybrid compounds to target the respiratory electron transport chain of mycobacterium tuberculosis

Publication . Nunes, Diogo Miguel de Oliveira; Lopes, Francisca da Conceição; Rocha, Maria de Jesus de Almeida Rainha Perry da Câmara Saldanha

A tuberculose, apesar de ser uma doença evitável e curável, mantém-se como uma epidemia global. Estima-se que em 2021, a tuberculose tenha sido a décima terceira maior causa de morte global e a segunda maior causa de morte induzida por um agente infecioso e que determinou, aproximadamente, 1,6 milhões de mortes. No mesmo ano, 10,6 milhões de pessoas terão contraído a doença e estimativas recentes indicam que um quarto da população mundial está infetado com o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o seu agente etiológico. O Mtb é um agente patogénico humano obrigatório, com várias características distintivas que o tornam um agente infecioso de excelência. Esta bactéria aproveita a resposta imunitária do hospedeiro para aumentar o grau de transmissão. Para além disso, possuí um arsenal metabólico extenso capaz de metabolizar os xenobióticos e uma parede celular única, com um elevado número de bombas de efluxo, que lhe confere uma alta impermeabilidade, permitindo-lhe adaptar-se às múltiplas pressões ambientais criadas pelo hospedeiro, adquirindo assim uma elevada resistência natural a fármacos. Por fim, esta micobactéria possui uma capacidade única de permanecer no hospedeiro num estado latente, caracterizado por uma fisiologia e metabolismo distinto, crescimento reduzido, tolerância a fármacos aumentada, e uma capacidade de não se deixar detetar pelo sistema imunitário. Um regime terapêutico anti-tubercular tem como objetivo diminuir a severidade da doença, evitar reincidências e o desenvolvimento de resistência, e para tal, necessita eliminar todas as populações de bacilos do hospedeiro. Devido às características próprias das bactérias latentes, os regimes terapêuticos anti-tuberculares têm durações bastante prolongadas e características de polimedicação, apresentando por isso efeitos adversos cumulativos. Consequentemente, os regimes terapêuticos anti-tuberculares têm baixa adesão e tolerância por parte dos doentes, podendo resultar na emergência de tuberculose resistente a fármacos, que está associada a uma maior letalidade, e a um sucesso terapêutico inferior. Desta forma, o desenvolvimento de um regime terapêutico curto, potente, e eficiente em todas as formas de infeção é uma prioridade no controlo da tuberculose. Para tal, é essencial desenvolver novos fármacos que sejam eficientes, seguros, e bem-tolerados, e que preferencialmente atuem por novos mecanismos de ação, de forma a evitar a emergência de resistência. Esta premência não foi considerada nos últimos anos, sendo que apenas três fármacos anti-tuberculares (bedaquilina, delamanida e pretomanida) foram aprovados nos últimos quarenta anos, todos com efeitos secundários que comprometem a sua utilização prolongada. Assim, é crucial investir na descoberta e desenvolvimento de novos fármacos ativos contra a tuberculose latente e resistente, preferencialmente com novos mecanismos de ação e alvos diferentes. A cadeia de transporte de eletrões do Mtb surgiu recentemente como um alvo promissor para novos fármacos anti-tuberculares. Atualmente, cerca de 30% dos novos fármacos em ensaios clínicos têm como alvo um elemento da cadeia de transporte de eletrões, e cerca de 65% dos regimes farmacológicos em ensaios clínicos de fase III incluem um fármaco que inibe a cadeia de transporte de eletrões. Como ambas as formas bacterianas, latentes e replicantes, requerem um fornecimento contínuo de ATP, o metabolismo energético é um alvo apelativo, já que a sua inibição e consequente disrupção do fornecimento de ATP permite eliminar eficientemente as populações replicantes e latentes, e consequentemente, diminuir a duração dos regimes terapêuticos e a emergência de resistência. Este projeto inclui a síntese e caracterização de uma pequena biblioteca de ferramentas farmacológicas híbridas, capazes de inibir o citocromo bc1-aa3, a oxidase principal do Mtb, e, em simultâneo, o citocromo bd, uma oxidase alternativa que o bacilo utiliza em situações de hipoxia. Deste modo, pretende-se que estes compostos consigam inibir eficientemente a produção de ATP, e eliminar ambas as populações bacterianas replicantes e latentes. Os compostos híbridos têm uma estrutura comum, com um esqueleto de pirroloquinolona, provavelmente capaz de inibir o citocromo bc1-aa3 uma vez que é inibidor do citocromo bc1 do Plasmodium falciparum, uma proteína com alta homologia com o citocromo bc1-aa3 do Mtb; e um esqueleto de nitrofurano, que podendo ser reduzido in vivo pelas nitroreductases do Mtb, liberta óxido nítrico capaz de inibir o citocromo bd. As duas estruturas serão ligadas por um braço de ligação, que será a porção variável da biblioteca de compostos. Os compostos foram sintetizados por uma estratégia de síntese divergente, iniciada com a síntese do esqueleto da pirroloquinolona, com rendimentos elevados. De seguida, vários braços de ligação foram acoplados, com rendimentos moderados. Quando necessário, foi efetuada uma redução das funções químicas do braço de ligação (grupos nitro e nitrilo), por forma a garantir a presença de um grupo amina livre. Por fim, o esqueleto de nitrofurano foi acoplado, com rendimentos baixos, através de dois tipos de ligação: ligações amida (7a – 7d) e ligações imina (8a – 8c). Todos os compostos foram obtidos puros, exceto o composto 7d, cujas tentativas de purificação não foram bem sucedidas. Na síntese do composto 7c, isolou-se um produto de degradação – uma nitrofuranilamida (composto 7c’) – que foi caracterizado. Como o composto 7c foi somente obtido puro posteriormente, por restrições temporais não foram efetuados os ensaios subsequentes para este composto. A solubilidade aquosa dos compostos foi determinada por HPLC para os compostos 7c’ e 8c. Este ensaio não foi efetuado com os restantes compostos ((7a), (7b), (8a) e (8b)) por se ter verificado que tinham sofrido degradação extensiva. Ambos os compostos 7c’ e 8c demonstraram ter boa solubilidade aquosa, que juntamente com as propriedades físico-químicas previstas indicam que estes compostos, provavelmente, terão uma boa biodisponibilidade oral. Também se avaliou a estabilidade química (em tampão PBS), em plasma, e metabólica (em microssomas de ratinho), por HPLC para os compostos 7c’ e 8c. Ambos demonstraram ter um bom perfil farmacocinético, sendo que o composto 7c’ demonstrou ser mais estável que o composto 8c nos três meios testados. Comparando a estabilidade do composto 7c’ com outros compostos híbridos, nenhuma correlação foi identificada entre a ausência do esqueleto da pirroloquinolona e uma melhoria no perfil farmacocinético. A atividade anti-micobacteriana dos compostos 7c’, 8c, e de alguns intermediários foi testada contra duas estirpes de M. tuberculosis (uma estirpe nativa, H37Rv, e uma estirpe mutante, cydKO). Os resultados estão de acordo com o mecanismo de ação proposto em que os compostos híbridos têm como alvos ambos os citocromos, bc1-aa3 e bd, e a necessidade do grupo nitro ser substituinte num ciclo heteroaromático. O composto 8c apresentou atividade anti-micobacteriana com valores de MIC na gama micromolar, demonstrando que estes compostos híbridos são agentes anti-tuberculares promissores. O composto 7c’ foi o composto mais ativo, apresentando atividade anti-micobacteriana com valores de MIC na gama sub-micromolar, podendo indicar um mecanismo de ação distinto, uma vez que esta molécula não contém a subunidade pirroloquinolona. A toxicidade dos compostos 7c’ e 8c, tal como do percursor 6c, foi testada contra a linha celular HEK293. Os compostos 7c’ e 6c não apresentaram citotoxicidade, enquanto o composto 8c apresentou citotoxicidade superior, apesar de demonstrar alguma seletividade para as células bacterianas. Deste modo, os próximos passos deste projeto incluem a realização de ensaios de atividade dos compostos 7c’ e 8c em outras bactérias, de forma a avaliar a seletividade destes compostos; a avaliação biológica e farmacocinética dos restantes compostos híbridos; e o aumento da biblioteca de compostos híbridos.

2022-12-22Master thesis

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Bio-triggered triazenes : a novel approach to release alkylating agents

Publication . Braga, Cláudia Marisa Fernandes; Rocha, Maria de Jesus de Almeida Rainha Perry da Câmara Saldanha; Moreira, Rui Ferreira Alves; Bernardes, Gonçalo José Lopes

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most prevalent and invasive type of glioma, and patients present a median survival time of only 14 months after diagnosis. Temozolomide (TMZ) is a triazene-based prodrug approved for the treatment of high-grade brain tumours such as GBM, however, the highly heterogeneous and wide-spreading nature of glioma cells often disrupts its efficacy, resulting in resistance to chemotherapy, lack of selectivity for cancer cells and high tumour recurrence. Similarly to TMZ, 1-aryl-3-methyltriazenes are alkylating agents that have been developed in prodrug forms for targeted drug delivery, with reported anti-tumoral activities in the micromolar range against melanoma and glioblastoma cell lines. In this work, we aimed to target hypoxia which represents a key feature of GBM microenvironment with a set of nitroaromatic-based triazene prodrugs 14a-f, 22a-f and 47a-c designed to be selectively activated under hypoxia to release the cytotoxic methyldiazonium ion. The incorporation of different nitroaromatic triggers translated into variable rates of reduction towards E. coli nitroreductase NfsB. Biological evaluation under normoxic and hypoxic cultures of LN-229 and U-87MG glioblastoma cell lines revealed that compounds 14b, 14d and 14e exhibited a more pronounced cytotoxic effect than the same dose of TMZ, with minimal toxicity against normal primary fibroblast cells. Moreover, cell death by apoptosis and ROS production revealed to be increased in the presence of the selected prodrugs. Furthermore, we designed a dual function chromenone-based fluorescent probe to be activated under hypoxia, using NOBF4 for adequate diazonium salt stabilization before monomethyltriazene formation. However, the synthetic route still requires optimization and further examination on the apparent instability of the final dual-function molecule. Finally, hybrid compounds based on valproic acid and DNA-alkylating triazene moieties previously designed for GBM chemotherapy, were evaluated in GL261 cell line and compounds 67d and 67e shown to be remarkably more potent against glioma cells and more efficient in decreasing invasive cell properties than TMZ. In contrast to TMZ, which undergoes hydrolysis to release an alkylating metabolite, the valproate hybrids showed a low potential to alkylate DNA. This work contributed with two new categories of triazene prodrugs with confirmed in vitro anti-cancer activity. Altogether, these data validate the feasibility of the incorporation of triazenes in targeted-drug delivery platforms specifically designed to target glioblastoma multiforme.

2022-09Doctoral thesis

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