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Characterizing the regulation of the CFTR protein by the kinase GRK5 in cystic fibrosis models

Publication . Caleiro, Mariana Ferreira; Botelho, Hugo Miguel Raposo Correia

A fibrose quística (FQ) é uma doença genética rara que afeta cerca de 160.000 pessoas em todo o mundo e cuja esperança média de vida ronda os 50 anos nos países desenvolvidos graças ao diagnóstico precoce e à disponibilidade de fármacos inovadores e eficazes. Esta doença afeta múltiplos órgãos, tais como as vias aéreas, os intestinos, o pâncreas, o fígado, e é causada pela herança de variantes patogénicas do gene do regulador de condutância transmembranar da fibrose quística (CFTR) em ambos os alelos. O gene CFTR codifica uma proteína com o mesmo nome e cuja função é conduzir iões cloreto (Cl- ) e bicarbonato (HCO3 - ) através da membrana plasmática (MP) das células epiteliais. A CFTR é um canal transmembranar composto por cinco domínios: dois domínios transmembranares (MSD1 e MSD2), dois domínios citosólicos de ligação de nucleótidos (NBD1 e NBD2) comuns entre os transportadores ATP-binding cassete (ABC), e um domínio regulador adicional (RD). Cada MSD é composto por 6 segmentos (TM1–TM6 e TM7–TM12) e forma o poro do canal que permite o fluxo transmembranar de Cle HCO3 - . NBD1 e NBD2 são essenciais para a regulação da CFTR, pois a sua dimerização dependente de adenosina trifosfato (ATP) é necessária à abertura (gating) do canal. Por fim, o RD consiste em uma região intrinsecamente desordenada cuja fosforilação por PKA leva à dimerização dos NBD. Aquando da síntese e enrolamento da CFTR no retículo endoplasmático, ocorre co-transducionalmente uma glicosilação que origina uma proteína imatura que será sujeita ao controlo de qualidade do retículo endoplasmático (ERQC). Encontrando-se corretamente enrolada, é transportada para o complexo de Golgi onde é concluída a glicosilação e alcançada a sua forma madura, que será depois transportada para a MP onde desempenhará a sua função. Até hoje, foram identificadas mais de 2100 variantes do gene CFTR, tanto patogénicas como não patogénicas. As variantes patogénicas podem comprometer o equilíbrio transepitelial de iões de diferentes formas. Atualmente, estas mutações estão agrupadas em 7 classes: Classe I inclui as mutações que prejudicam a produção de CFTR levando geralmente à degradação do mRNA (principalmente mutações nonsense); Classe II inclui mutações que resultam num enrolamento incorreto da CFTR e que levam à sua retenção pelo mecanismo de ERQC e subsequente degradação, reduzindo substancialmente o tráfego de CFTR para a membrana bem como a sua função. A p.Phe508del, a variante mais comum em indivíduos com FQ, é um exemplo de mutação de classe II; Classe III inclui as mutações que afetam o gating do canal; Classe IV inclui mutações que resultam na redução da condutância de Cle HCO3 - ; Classe V inclui mutações que levam à geração de mRNA aberrante por splicing alternativo; Classe VI inclui as mutações que resultam na destabilização da CFTR na MP, por aumento da endocitose ou diminuição da sua reciclagem de volta à MP; Classe VII inclui mutações conhecidas como irresgatáveis visto que inibem a síntese de mRNA e, consequentemente, de proteína CFTR. Quando a CFTR não se encontra funcional na MP, a absorção de fluidos e secreção de iões fica comprometida, o que leva á perda de homeostase transepitelial que resulta na produção de muco espesso. A presença de muco espesso e mais ácido que o normal compromete o normal funcionamento dos cílios resultando na obstrução das vias aéreas e no surgimento de infeções bacterianas recorrentes, capazes de desencadear respostas inflamatórias crónicas que levam à destruição progressiva do tecido pulmonar resultando eventualmente em insuficiência respiratória. A insuficiência respiratória é a principal causa de morbidade e mortalidade entre indivíduos com FQ. Só a partir de 2012, surgiram opções terapêuticas focadas não no controlo dos sintomas, mas sim na correção dos defeitos primários das variantes CFTR patogénicas – medicamentos chamados moduladores da CFTR. Os moduladores aprovados aumentam o enrolamento e o tráfego da CFTR (corretores) ou a abertura dos canais já presentes na MP (potenciadores). Atualmente estão aprovados pela Agência Europeia de Medicamentos (EMA) e pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA quatro moduladores da CFTR: os corretores lumacaftor (VX-809), tezacaftor (VX-661) e elexacaftor (VX-445), e o potenciador ivacaftor (VX-770). Em 2019, uma combinação de alta eficiência composta por elexacaftor, tezacaftor e ivacaftor, conhecida comercialmente como Kaftrio, foi aprovada para uso clínico. No entanto, estes medicamentos inovadores estão disponíveis apenas para indivíduos com um ou dois alelos p.Phe508del-CFTR. Mesmo para genótipos p.Phe508del-CFTR, estes medicamentos – a única terapêutica que visa a origem da patologia – têm custo bastante elevado, tornando necessário o desenvolvimento de novas terapias para indivíduos portadores de p.Phe508del-CFTR. Por outro lado, apesar de ser a variante mais comum, é de extrema importância o desenvolvimento de opções terapêuticas para indivíduos com FQ portadores de outras variantes. O nosso grupo identificou anteriormente a cinase 5 do receptor acoplado à proteína G (GRK5) como um novo regulador da p.Phe508del-CFTR. Nesse estudo, a regulação de p.Phe508del-CFTR pela GRK5 foi confirmada por meio de silenciamento com siRNAs e inibição com compostos inibitórios específicos. Foi observado que a inibição da GRK5 pode restaurar o tráfego de p.Phe508del-CFTR para a MP e apresenta um efeito aditivo a moduladores de CFTR usados atualmente. No entanto, a base molecular para a regulação de p.Phe508del-CFTR por meio de GRK5 é desconhecida. As cinases do recetor acoplado à proteína G (GRK) são serina/treonina cinases conhecidas por modularem a sinalização de recetores acoplados à proteína G (GPCR), através da sua dessensibilização. Este processo canónico é comum a todas as GRK (GRK1-7) e essencial para a proteção das células e tecidos contra a exposição prolongada a ligantes bem como sustentar a resposta fisiológica contínua a estímulos. A GRK5 está também envolvida noutros processos moleculares tais como: regulação da hipertrofia cardíaca por meio da fosforilação da histona desacetilase 5 (HDAC5), redução da inflamação pela fosforilação de NF-κB p105, aumento da polimerização e agregação de α-sinucleína pela fosforilação da mesma. Até recentemente, todos os inibidores de GRK5 disponíveis eram inespecíficos, inibindo também a GRK2. Alguns exemplos destes inibidores são o Sunitinib, um inibidor do recetor tirosina cinase aprovado pela FDA também capaz de inibir a GRK5, e o Ullrich 57, composto derivado da estrutura indolinona do Sunitinib. Os primeiros inibidores GRK5 seletivos e potentes foram desenvolvidos por Andrew D. White e pelo seu grupo, que geraram uma série de inibidores da GRK5 a partir do scaffold Ullrich 57. Dos inibidores gerados, os três mais seletivos e potentes foram CCG273463, CCG273441 e GRL018-21. Posto isto, o objetivo deste trabalho foi avaliar e caracterizar o resgate do tráfego e da função da p.Phe508del-CFTR aquando da inibição da GRK5, e verificar a existência de aditividade com os moduladores de CFTR VX-661 e VX-445. Para a inibição da GRK5, foi utilizado um inibidor seletivo, CCG273441, tanto sozinho como em combinação com os moduladores referidos. Os nossos resultados permitiram-nos entender melhor o funcionamento da via de sinalização de GRK5-CFTR e como a inibição de GRK5 é capaz de resgatar o tráfego e a função de p.Phe508delCFTR. Foi também possível confirmar a sinergia da inibição da GRK5 com moduladores de CFTR. Uma vez inibida a GRK5, a quantidade total de p.Phe508del-CFTR nas células aumenta, havendo assim mais CFTR disponível para ser corrigida pelos moduladores e consequentemente uma quantidade aumentada de CFTR funcional no MP. Em conclusão, os nossos resultados mostram que a GRK5 regula p.Phe508del-CFTR interferindo ao nível da produção e/ou degradação de CFTR.

2024Master thesis

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Chemical Profile and Biological Activities of Brassica rapa and Brassica napus Ex Situ Collection from Portugal

Publication . Serrano, Carmo; Oliveira, M. Conceição; Lopes, V. R.; Soares, Andreia; Molina, Adriana K.; Paschoalinotto, Beatriz H.; Pires, Tânia C. S. P.; Serra, Octávio; Barata, Ana M.

This study aimed to analyse the chemical profile and biological activities of 29 accessions of Brassica rapa (turnips) and 9 of Brassica napus (turnips and seeds) collections, maintained ex situ in Por- tugal. HPLC-HRMS allowed the determination of glucosinolates (GLS) and polyphenolic compounds. The antioxidant and antimicrobial activities were determined by using relevant assays. The chemical profiles showed that glucosamine, gluconasturtiin, and neoglucobrassin were the most abundant GLS in the extracts from the turnip accessions. Minor forms of GLS include gluconapoleiferin, glucobrassicanapin, glucoerucin, glucobrassin, and 4-hydroxyglucobrassin. Both species exhibited strong antioxidant activity, attributed to glucosinolates and phenolic compounds. The methanol extracts of Brassica rapa accessions were assessed against a panel of five Gram-negative bacteria (Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica subsp. enterica serovar, and Yersinia enterocolitica) and three Gram-positive bacteria (Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus). The extracts exhibited activity against S. enterica and S. aureus, and two showed inhibitory activity against E. coli and Y. enterocolitica. This study provides valuable insights into the chemical composition and biological properties of Brassica rapa and Brassica napus collections in Portugal. The selected accessions can constitute potential sources of natural antioxidants and bioactive compounds, which can be used in breeding programs and improving human health and to promote healthy food systems.

2024-04Journal article

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Optimized metrological and geochemical assessment of trends in estuarine and oceanic systems

Publication . Borges, Carlos; Silva, Ricardo Jorge Neves Bettencourt da; Palma, Carla Maria Ferreira Mesquita

The evaluation of the environmental status and evolution of an ecosystem is a crucial element to support decision-makers in their management. Such evaluation must incorporate the uncertainty of collected information to allow their objective and binding interpretation. However, up to now, there were no tools for the objective interpretation of environmental monitoring data that consider system heterogeneity and the impact of the sampling strategy in system characterization, making these monitoring inefficient. The main goal of this work was to produce tools, implemented in user-friendly software, for the objective assessment of the status, trends and correlations of relevant parameters of vast environmental areas, to produce biding information for the management of these resources. The Monte Carlo Method simulation of the spatial distribution of studied parameters considering sampling positioning and sample analysis uncertainty, and conservative interpolation of information between sampling points, allowed simulating mean compositional values, trends and correlations with known uncertainty. This tool was applied to study a large estuarine system from the Tagus River and an even larger coastal area from the Portuguese Continental Platform. The developed tool was successfully applied to study nutrients and characteristic oceanographic features in the oceanic area. The tool was developed for areas monitored from up to 100 points using prior information from studied quantities while keeping the studied parameter’s correlation. The application of the developed tools to the above-mentioned systems in different seasonal conditions allowed the objective and metrologically sound evaluation of trends and correlations of studied parameters. This work aims to change the paradigm of probably the most demanding analytical challenge, the monitoring of vast environmental areas, contributing to the objectivity ambitioned for these studies.

2025-01-23Doctoral thesis

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Natural organic matter dynamics in permafrost peatlands: critical overview of recent findings and characterization tools

Publication . Folhas, Diogo; Couture, Raoul-Marie; Laurion, Isabelle; Vieira, Gonçalo; Canário, João

Rising temperatures are destabilizing permafrost in northern latitudes, leading to the mobilization, transformation and cycling of natural organic matter (NOM), nutrients, and contaminants into newly formed aquatic systems. Analyzing the chemical composition of organic matter is crucial for understanding the biogeochemical processes at play. Furthermore, it is essential to investigate how seasonal variations and anoxic conditions influence these processes, as well as their effects on microbial activity and NOM composition. This review provides an overview of northern peatlands, terminal electron acceptor species, and key analytical techniques used to characterize organic matter: UV/Vis and Fluorescence Spectroscopy, FTIR, FT-ICR-MS, and Nuclear Magnetic Resonance. Rather than focusing on the theoretical aspects of these techniques, we emphasize the type of information they offer about NOM and how to interpret these data within the context of biogeochemical transformations in permafrost-affected systems.

2025Journal article

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Recent advances in the study of mercury biogeochemistry in Arctic permafrost ecosystems

Publication . Malcata Martins, Beatriz; Hintelmann, Holger; Pilote, Martin; Vieira, Gonçalo; Canário, João

Permafrost predominates in polar and high mountain regions, encompassing nearly 15 % of the exposed land in the Northern Hemisphere. It denotes soil or rock that remains at or below 0 °C for the duration of at least two consecutive years. These frozen soils serve as a barrier to contaminants that are stored and accumulated in permafrost over extended periods of time. One of these chemical compounds is mercury (Hg), a heavy metal well recognized for its severe toxic effects. Mercury presents a major risk worldwide to ecosystems, biota and human health and is strengthened by the Minamata Convention on Mercury. The International Panel on Climate Change (IPCC) scientific group monitors and assesses the science related to climate change and highlights the significant impacts of global warming. The phenomenon known as Arctic amplification has accentuated warming of the Arctic in recent years and has led to the degradation and rapid thawing of permafrost. This process has significant implications in hydrology of the ecosystems and for the mobility of previously sequestered carbon and trace metals, such as Hg, with possible adverse environmental and human health impacts. In this article, we provide a comprehensive review of the current understanding of the Hg cycle in permafrost regions, exploring the effects of global warming on these intricate processes. Additionally, we highlight existing research gaps and propose directions for future investigations.

2025Journal article

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