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Potencial benefício da utilização de terapia genética com vetores de expressão que codificam para o CYP46A1 na correção do fenótipo hepático na doença de NPC
Publication . Gomes, Fátima Cristina Andrade; Rodrigues, Elsa Margarida Teixeira
A doença de Niemann-Pick tipo C (NPC) é uma doença rara, crónica, progressiva e
neurodegenerativa que é caraterizada por um defeito no transporte de vários glicolípidos e do
colesterol livre, originando a acumulação destes nos lisossomas de vários tecidos, como o
fígado e o encéfalo. Embora a neurodegeneração seja a maior causa de mortalidade nos doentes
NPC, estes apresentam uma predisposição para desenvolver um fenótipo metabólico alterado
que se torna mais evidente durante a progressão da doença. A hepatomegalia é uma das
manifestações mais comuns e geralmente precede o envolvimento neurológico da doença.
O enzima 24-hidroxilase do colesterol (CYP46A1) catalisa a hidroxilação do colesterol
encefálico a 24(S)-hidroxiesterol e apresenta um padrão de expressão específico no Sistema
Nervoso Central, constituindo a principal via de eliminação do colesterol do encéfalo. Com
base em resultados preliminares do nosso grupo de trabalho, formulámos a hipótese de que o
CYP46A1 poderia ser um potencial alvo terapêutico na doença de NPC. Desta forma, e tendo
em consideração o facto de existirem opções terapêuticas muito limitadas para esta doença, o
objetivo principal desta tese foi determinar o efeito da expressão ectópica do CYP46A1 no
fenótipo hepático de murganhos Npc1tm(I1061T), focando no metabolismo não apenas do
colesterol, mas também dos ácidos gordos e dos triglicéridos.
Os nossos resultados mostram que o CYP46A1 pode ter papel benéfico na melhoria do
fenótipo hepático característico da doença de NPC, uma vez que reduz a hepatomegalia e o
aumento nos níveis séricos de alanina aminotransferase de murganhos NPC1. No entanto a
expressão ectópica de CYP46A1 induz um aumento nos níveis de colesterol total, relativamente
aos encontrados no fígado de murganhos Npc1tm(I1061T), não afectando os níveis de ácidos
gordos e triglicéridos. A análise dos níveis de mRNA de genes envolvidos no metabolismo
lipídico, revelou pela primeira vez diferenças significativas no padrão de expressão de genes
envolvidos no metabolismo lipídico no fígado de murganhos machos e fêmeas NPC, bem como
no efeito da expressão do CYP46A1.
No seu conjunto, os nossos resultados sugerem que o efeito off-target da expressão do
CYP46A1 influencia, de facto, a função hepática, e que poderá ter um papel benéfico no
fenótipo hepático da doença de NPC.
Restoring cholesterol homeostasis in neurons by cyp46a1 does not stall the progression of niemann-pick type C disease
Publication . Reis, Joana Pinheiro Leite da Anunciação; Nunes, Maria João de Jesus; Rodrigues, Elsa Margarida Teixeira
A enzima colesterol 24-hidroxilase (CYP46A1) consiste num citocromo P450 neuro-específico, que catalisa a conversão do colesterol em 24S-hydroxycholesterol, constituindo a principal via de eliminação do colesterol no encéfalo. Tem assim um papel crucial na manutenção do normal metabolismo do colesterol, tendo em conta que o encéfalo é o órgão do corpo humano com maior teor de colesterol. Em estudos prévios do nosso grupo, em que foram utilizados diferentes modelos celulares da doença de Niemann-Pick type C (NPC), o CYP46A1 foi sugerido como um potencial alvo terapêutico nesta patologia. Isto deve-se à capacidade do CYP46A1 em corrigir a acumulação de colesterol não-esterificado nos endossomas tardios /lisossomas (LE/L), que constitui a principal característica da doença de NPC. Este fenótipo é originado por mutação na proteína NPC1, localizada na membrana dos LE/L, e responsável pelo efluxo e reciclagem do colesterol internalizado sob a forma de lipoproteínas. A doença de NPC é uma doença rara, com alternativas terapêuticas muito limitadas. A sintomatologia que a caracteriza é diversa e afeta o encéfalo, fígado e o baço. Na maioria dos casos, a doença manifesta-se durante a infância ou início da adolescência, sendo que os pacientes apresentam um comprometimento progressivo da função motora e intelectual, que geralmente levam à morte nas duas primeiras décadas de vida. Entre as alterações patológicas neuro-viscerais, um sintoma principal da doença de NPC é a ataxia cerebelar, que é resultante da perda progressiva de células de Purkinje. O mecanismo responsável pela perda neuronal acentuada não se encontra ainda definido, porém, o desequilíbrio induzido pela acumulação de colesterol é frequentemente tido em conta como agravante, senão mesmo a causa da doença. De facto, a desregulação da homeostase do colesterol está subjacente ao processo neurodegenerativo, induzindo um bloqueio do fluxo autofágico e um aumento da neuro-inflamação. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a expressão do CYP46A1 promove a melhoria do fenótipo da doença, com foco nas principais características patológicas, incluindo a desregulação da homeostase do colesterol, neuro-inflamação e bloqueio da autofagia. Para isso, aumentámos os níveis de CYP46A1 utilizando vírus adeno-associados, num modelo murganho da doença de NPC. Estes animais, Npc1tm(I1061T), possuem o knock-in da mutação I1061T no gene que codifica para a proteína NPC1, que é a mais frequente encontrada nos humanos.
Os nossos resultados mostraram que a expressão ectópica de CYP46A1 impediu parcialmente a perda de peso e a hepatomegalia observada os murganhos NPC. Além disso, o CYP46A1 promoveu uma correção significativa dos níveis de mRNA de genes envolvidos na síntese, captação, efluxo e esterificação do colesterol. A este efeito, foi também associada uma promoção da redistribuição do colesterol não esterificado acumulado nos LE/L, que foi sugerida através da análise por marcação de cortes parasagitais do córtex dos animais com filipina III. A partir destes resultados, foi possível concluir que as células do cerebelo e córtex dos animais NPC estão de facto a responder à normalização da homeostase do colesterol promovida pela expressão do CYP46A1.
Outra característica impactante da doença de NPC é a neuro-inflamação, que é evidenciada pela ativação de microglia, que inicia uma cascata neurodegenerativa e leva à ativação de astrócitos. A expressão de CYP46A1 corrigiu parcialmente os níveis de mRNA aumentados de alguns marcadores de microglia característicos de um fenótipo mais pró-inflamatório no cerebelo dos murganhos NPC, e em simultâneo induziu um aumento dos níveis de expressão de Arginase 1 e do Fator de Transformação do crescimento β1. Esta alteração do perfil inflamatório da microglia foi corroborada por ensaios de imunohistoquímica, em que foram analisados os níveis da molécula adaptadora de ligação ao cálcio 1 (Iba-1), em várias regiões do cerebelo dos murganhos, nomeadamente o núcleo cerebelar profundo e as camadas molecular e granular dos lóbulos do cerebelo, e que sugerem uma diminuição da ativação da microglia por parte do CYP46A1. No entanto, não foi observada nenhuma melhoria relativamente ao perfil de ativação de astrócitos.
Concomitante com a correção da homeostasia do colesterol, foi também registado um restabelecimento dos níveis de mRNA da enzima lisosomal Catepsina D o que sugere uma melhoria parcial da desregulação lisossomal caraterística da doença de NPC. Visto que a disfunção lisossomal está associada aos defeitos na autofagia verificados nesta doença, foram efetuados estudos in vitro recorrendo a células HeLa em que foi efetuado o knock-down da proteína NPC (NPC-KO). O aumento da expressão do CYP46A1 com recurso a transdução com vectores de adenovírus, confirmaram os resultados previamente obtidos pelo nosso grupo no modelo animal NPC, ao indicar que a expressão de CYP46A1 promove a restauração do fluxo autofágico. Este efeito foi observado através de uma redução na acumulação da forma lipidada da proteína 1 de cadeia leve 3 associada a microtúbulos (LC3-II), bem como através da análise dos níveis de mRNA de genes envolvidos na regulação da autofagia.
Embora uma melhoria das várias características patológicas principais da doença de NPC tenha sido registada em resposta à expressão de CYP46A1, a degeneração das células de Purkinje não foi revertida no cerebelo dos murganhos NPC. Esta análise decorreu do cálculo da densidade de células de Purkinje após marcação dos tecidos com Violeta de Cresil e posterior confirmação através de marcação com um anticorpo anti-Calbindina através de imunofluorescência.
Os resultados apresentados neste estudo demonstram que a correção da homeostase do colesterol mediada por CYP46A1 em murganhos NPC não é suficiente para prevenir a morte de células neuronais, realçando o papel de outros lípidos neurotóxicos na etiologia desta doença. No entanto, a expressão de CYP46A1 promoveu a reversão de importantes aspetos patológicos da doença, nomeadamente a normalização do metabolismo do colesterol, regularização do fluxo autofágico e diminuição da neuro-inflamação. Sendo estes aspetos característicos também de variadas outras doenças neurodegenerativas, o CYP46A1 poderá então representar uma abordagem terapêutica válida em diferentes contextos.
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Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/MED-NEU/29455/2017