MyPATH- Insights into Mycobacterium tuberculosis complex PATHogenesis: assessing the benefit of confinement-induced biofilm strategies by comparative genomics

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Non-Tuberculous Mycobacteria: Molecular and Physiological Bases of Virulence and Adaptation to Ecological Niches

Publication . Pereira, André C.; Ramos, Beatriz; Reis, Ana C.; Cunha, Mónica V.

Non-tuberculous mycobacteria (NTM) are paradigmatic colonizers of the total environment, circulating at the interfaces of the atmosphere, lithosphere, hydrosphere, biosphere, and anthroposphere. Their striking adaptive ecology on the interconnection of multiple spheres results from the combination of several biological features related to their exclusive hydrophobic and lipid-rich impermeable cell wall, transcriptional regulation signatures, biofilm phenotype, and symbiosis with protozoa. This unique blend of traits is reviewed in this work, with highlights to the prodigious plasticity and persistence hallmarks of NTM in a wide diversity of environments, from extreme natural milieus to microniches in the human body. Knowledge on the taxonomy, evolution, and functional diversity of NTM is updated, as well as the molecular and physiological bases for environmental adaptation, tolerance to xenobiotics, and infection biology in the human and non-human host. The complex interplay between individual, species-specific and ecological niche traits contributing to NTM resilience across ecosystems are also explored. This work hinges current understandings of NTM, approaching their biology and heterogeneity from several angles and reinforcing the complexity of these microorganisms often associated with a multiplicity of diseases, including pulmonary, soft-tissue, or milliary. In addition to emphasizing the cornerstones of knowledge involving these bacteria, we identify research gaps that need to be addressed, stressing out the need for decision-makers to recognize NTM infection as a public health issue that has to be tackled, especially when considering an increasingly susceptible elderly and immunocompromised population in developed countries, as well as in low- or middle-income countries, where NTM infections are still highly misdiagnosed and neglected.

2020-09Journal article

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Animal tuberculosis: impact of disease heterogeneity in transmission, diagnosis, and control

Publication . Pereira, André C.; Reis, Ana C.; Ramos, Beatriz; Cunha, Mónica V.

Animal tuberculosis (TB) in terrestrial mammals is mainly caused by Mycobacterium bovis. This pathogen is adapted to a wide range of host species, representing a threat to livestock, wildlife and human health. Disease heterogeneity is a hallmark of multi-host TB and a challenge for control. Drivers of animal TB heterogeneity are very diverse and may act at the level of the causative agent, the host species, the interface between mycobacteria and the host, community of hosts, the environment and even policy behind control programmes. In this paper, we examine the drivers that seem to contribute to this phenomenon. We begin by reviewing evidence accumulated to date supporting the consensus that a complex range of genetic, biological and socio-environmental factors contribute to the establishment and maintenance of animal TB, setting the grounds for heterogeneity. We then highlight the complex interplay between individual, species-specific and community protective factors with risk/maintenance variables that include animal movements and densities, co-infection and super-shedders. We finally consider how current interventions should seek to consider and explore heterogeneity in order to tackle potential limitations for diagnosis and control programmes, simultaneously increasing their efficacy.

2020-09Journal article

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Insights into the transcriptional regulation of pks1 and pks15 among Mycobacterium tuberculosis complex bacteria

Publication . Ramos, Beatriz Gameiro; Cunha, Mónica Vieira

O género Mycobacterium pertence ao filo Actinobacteria, sendo o único membro da família Mycobacteriaceae e tendo mais de 170 espécies descritas. As micobactérias têm como principais características o seu elevado conteúdo em G+C (61-71%) e a propriedade de álcool-ácido resistência, atribuída à presença de ácidos micólicos na sua parede celular. As bactérias deste género podem ser agrupadas de acordo com o seu crescimento, estando no primeiro grupo incluídas as espécies de crescimento-lento, tais como Mycobacterium tuberculosis (Mtb), Mycobacterium bovis (Mb) e Mycobacterium leprae e, num segundo, as espécies de crescimento-rápido, maioritariamente oportunistas e não-patogénicas, como Mycobacterium smegmatis. Além desta divisão das espécies pelo seu crescimento, estas são também agrupadas segundo a sua semelhança genética, nomeadamente no complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC), composto por Mtb e por outros ecótipos que partilham, ao nível das sequências nucleotídicas do genoma, mais de 99% de semelhança. Os diferentes ecótipos são identificados de acordo com marcadores moleculares determinados, nomeadamente 14 regiões de diferença (RD’s) e seis regiões de eliminação (RvD’s). Entre os 20 marcadores moleculares, destacam-se RD9 e TbD1. A linhagem que apresenta a eliminação da RD9 inclui M. africanum, juntamente com outras espécies presentes em reservatórios animais, tais como, M. microti, M. pinnipedii, M. bovis, M. caprae, M. mungi e M. orygis. A eliminação de TbD1 carateriza um grupo de linhagens designadas de estirpes “modernas” de Mtb, enquanto os restantes membros de MTC não apresentam esta deleção. A espécie Mtb é o agente etiológico paradigmático da tuberculose (TB) humana. Ao nível mundial, a TB encontra-se no top 10 de causas de morte por infeção, acima da infeção por HIV/SIDA. Apesar de, nos últimos anos, se ter verificado uma diminuição das taxas de mortalidade e incidência, a doença mantém-se distribuída mundialmente, com principal incidência em Africa, na Ásia e na Europa oriental. A doença tem expressão, maioritariamente, pulmonar, mas 15% dos casos notificados em 2015 à Organização Mundial de Saúde (OMS) representam TB extrapulmonar. Em 2015, foram também notificados 480 mil casos de TB multirresistente (MDR-TB). A MDR-TB é prevalente em doentes previamente expostos a tratamentos anti-TB de forma irregular, favorecendo a seleção de mutantes resistentes. Mb, sendo um ecótipo adaptado a ungulados e carnívoros, é um agente zoonótico de TB em humanos, sendo que a infeção não é distinguível clinicamente da infeção causada por Mtb. Tipicamente, esta infeção ocorre por inalação de aerossóis em pessoas em contacto próximo com animais infetados ou por ingestão de leite não pasteurizado. A extensão da infeção por Mtb é dependente de dois parâmetros, a virulência da estirpe infetante e a competência da resposta imune do hospedeiro. As micobactérias patogénicas apresentam-se largamente adaptadas à sobrevivência dentro de macrófagos. Graças à inibição da fusão dos endossomas com os lisossomas, as micobactérias evadem-se dos mecanismos bactericidas que ocorrem nos lisossomas. A infiltração linfocitária e a ação concertada dos componentes do sistema imunitário no local da infeção limitam a disseminação das micobactérias numa estrutura designada granuloma. Durante a permanência dos bacilos no granuloma, estes são sujeitos a diversos fatores de stress, tais como hipoxia, escassez de nutrientes e pH acídico, que conduzem ao desenvolvendo de um estado de latência, não replicativo. O metabolismo micobacteriano é, no entanto, reativado mediante a supressão do sistema imunitário do hospedeiro. A parede celular das micobactérias é uma das suas principais características, sendo constituída por três estruturas, incluindo polissacáridos capsulares. O centro da parede celular é composto por peptidoglicano em ligação covalente com arabinogalactano que, por sua vez, está esterificado aos ácidos micólicos. Na parede estão também presentes glicolípidos, lipoglicanos e lipoproteínas. Entre os componentes específicos de Mycobacterium, estão os dimicocerosatos de ftiocerol (DIM) e os glicolípidos fenólicos (PGL), os quais têm sido associados à impermeabilidade da parede celular, à fagocitose, aos mecanismos de defesa contra os stresses oxidativo e nitrosativo e, teoricamente, à capacidade das micobactérias formarem biofilmes. A maioria dos genes responsáveis pela biossíntese de DIM e PGL estão localizados no locus DIM + PGL, nomeadamente os genes fadD26, ppsA-E, fadD28, lppX, pks15, pks1, fadD22, Rv2949c e fadD29. Entre estes, os genes pks1 e pks15 estão documentados como estando envolvidos na síntese de PGL, sendo que constituem uma única grelha de leitura aberta (pks15/1) em estirpes produtoras de PGL. Apesar de se conhecer a associação de pks15/1 a esta via biossintética, ainda não se encontra esclarecida a sua regulação transcricional. Tal como noutros procariotas, a transcrição em micobactérias é regulada pela associação de fatores σ à RNA polimerase, que assim formam uma holoenzima funcional na ativação da expressão génica. Cada fator tem afinidade para sequências promotoras específicas, regulando a expressão de genes alvo. Os 13 fatores σ descritos em micobactérias têm sido associados a diferentes condições de crescimento, nomeadamente o factor σA que assegura a expressão constitutiva de muitos genes do genoma micobacteriano, e o factor σB, associado à resposta geral ao stress. A função destes fatores tem sido estudado nos últimos anos por recurso à análise dos respetivos níveis de expressão e, mais recentemente, através de mutantes de eliminação, uma vez que o seu nível de expressão pode não representar diretamente a condição em que o fator efetivamente se associa à RNA polimerase. Neste trabalho, procurou-se esclarecer aspetos regulatórios e funcionais dos genes pks1 e pks15, que se sabe estarem envolvidos na biossíntese de PGL. Estudos prévios do nosso grupo de investigação analisaram a diversidade nucleotídica e aminoacídica destes genes, bem como a sua historia microevolutiva. Além disso, analisou-se também previamente a associação entre a formação de biofilme e o perfil dos lípidos de membrana de micobactérias patogénicas, em diferentes condições de stress nitrosativo e oxidativo, incluindo na presença de ácido ascórbico. O aumento de expressão destes genes nessas condições foi demonstrado por RT-qPCR. No entanto, uma vez que a informação disponível sobre os aspetos mecanísticos que regulam a expressão destes genes é reduzida, os objetivos do presente trabalho foram especificamente: [1] aferir se os genes pks1 e pks15 se encontram numa estrutura policistronica, através da construção de vetores de fusão transcricional e inferência da localização exata e condições de ativação do promotor; [2] estudar a função do gene pks1 através da construção de mutante de eliminação de pks1 por mutagénese mediada por fagos e por recombineering; e [3] inferir o padrão de regulação transcricional dos genes pks1 e pks15 pela análise de dados em larga escala do transcritoma (RNA-seq). A clonagem das regiões promotoras dos genes pks15, pks1, fadD22 foi inicialmente realizada no vetor pJET1.2/blunt, sendo bem-sucedida para os três alvos. Pelo contrário, a subclonagem dos mesmos alvos no vetor de fusão transcricional pSM128, replicativo em Escherichia coli e micobactérias, não foi concluída com sucesso, apesar das várias tentativas de otimização do rácio inserto:vector e das condições de ligação. Da mesma forma, a construção do mutante de eliminação do gene pks1 pelas duas abordagens independentes previstas não foi concluída. Pela metodologia de recombineering, foi possível gerar uma estirpe recombinante de Msm contendo o plasmídeo pJV53, sendo que não foi possível recuperar nenhuma estirpe contendo o substrato de troca alélica. Através da mutagénese mediada por fagos, o constrangimento encontrou-se na dimensão do DNA plasmídico que se pretendia construir para transdução, uma vez que a clonagem do substrato de troca alélica construído em cosmídeo no fagemídeo derivado do fago lambda gera uma construção que ultrapassa os 50 kb, ultrapassando também o limite máximo de extração da maioria dos sistemas comerciais e de métodos in-house, dificultando enormemente a recuperação do DNA plasmídico e a confirmação da obtenção do substrato transdutor. Para inferir a regulação transcricional dos genes em estudo, recolheu-se a informação disponível em diversas bases de dados, tais como Tuberculist, National Center for Biotechnology Information (NCBI), TB Database e MTB Network Portal. Além destes dados, a pesquisa do local de ligação do ribossoma (RBS) foi realizada através do Prokaryotic Dynamic Programming Genefinding Algorithm (PRODIGAL). A análise de sintenia foi também realizada para os genes pks1, pks15 e fadD22 através do SyntTax (Prokaryotic Synteny & Taxonomy Explorer). Para tentar definir o padrão e a mecanística da regulação transcricional, foi realizada uma análise de dados em larga escala do transcritoma, obtidos por RNA-seq, constituindo um conjunto de 27 condições experimentais (25 para Mtb e 2 para Mb) e um total de 77 replicados (60 para Mtb e 17 para Mb), para um grupo de 52 (Mtb) e 50 (Mb) genes codificando sintetases de poliquétidos, fatores σ e membros dos módulos de bicluster 0211 e 0490 definidos pelo algoritmo cMonkey (disponíveis no MTB Network Portal). A informação recolhida de bases de dados sugere que os genes pks1 e pks15 poderão formar uma unidade transcricional composta por 3 a 6 genes, localizados tanto a montante do gene pks15 como a jusante do gene pks1. Destes 6 genes (lppX, pks1, pks15, fadD22, Rv2949c e fadD29), apenas o gene lppX não está envolvido na síntese de fenoltiocerol. Dados anteriores baseados na análise in silico indicam que os genes pks1 e pks15 são putativamente regulados positivamente por sigK e negativamente por sigE. No presente trabalho, a análise dos dados de transcritoma indicou que, para Mtb, é possível associar num único cluster, com pelo menos 85% de semelhança, aferida pelo método de aglomeração UPGMA, os genes pks1, fadD22, Rv2949c, fadD29, pks6, pks12 e pks9. Para Mb, devido à existência de um grupo menor de dados, um cluster com o mesmo nível de semelhança inclui os genes lppX, pks15/1, fadD22, Rv2949c, fadD29 e, ainda, os genes Mb0429c e pks13. Os dados de transcritoma sugerem ainda uma associação entre os membros da estrutura policistrónica putativa e os genes que codificam para os fatores σC, σG e σK, aferida por um coeficiente de correlação de Pearson superior a 0,8. Com os dados de RNA-seq, foi também possível estabelecer uma analise de expressão diferencial que permite identificar, por comparação, em que condições os membros da estrutura policistronica putativa estão sobre e subexpressos. Dentro do lote de condições analisadas, que inclui pH acídico, fontes de carbono alternativas, diferentes fases do crescimento bacteriano, exposição a diferentes concentrações de ferro, hipoxia e latência, apenas foi verificada a sobre-expressão dos genes alvo na amostra crescida em pH acídico, quando comparada com a amostra crescida em pH neutro. A adição de piruvato como fonte de carbono alternativa ao meio de cultura não promoveu alterações significativas na expressão dos genes alvo, quando comparando com as amostras crescidas unicamente em glicerol. A comparação das amostras recolhidas em fase estacionária do crescimento com as amostras recolhidas em fase exponencial, no mesmo meio de cultura, revelaram a subexpressão dos genes alvo em fase estacionária, tal como previsto. Tanto para as amostras crescidas em alta como em baixa concentração de ferro, os genes alvo aparentam ser subexpressos por comparação com a amostra crescida em condições de crescimento padrão in vitro. Tanto para as amostras recolhidas da cultura em hipoxia, como para as amostras recolhidas da cultura em latência, os genes alvos apresentam elevada subexpressão. Para Mb, analisaram-se ainda culturas crescidas em condições de carência nutricional, revelando o mesmo padrão apresentado em Mtb para culturas em hipoxia e latência. A combinação da informação resultante da análise de clustering e da análise de expressão diferencial parece apontar para que o gene lppX, de função parcialmente desconhecida, tenha uma regulação transcricional mais divergente da dos restantes genes alvo. Confirma-se, assim, neste trabalho que os genes em estudo são regulados positivamente em pH ácido e subexpressos em fase estacionária, sob hipoxia e latência e em concentrações baixas e altas de ferro. A regulação negativa destes genes nestas últimas condições é consistente com o estado não replicativo das micobactérias no seio do hospedeiro e a subsequente redução da síntese de componentes da parede celular à medida que os processos celulares essenciais da bactéria são afetados pela resposta do sistema imunitário do hospedeiro. A análise de expressão diferencial baseada no transcritoma permitiu também confirmar que o gene sigK partilha o padrão de expressão com os genes de interesse em 80% das situações analisadas que apresentam diferenças de expressão significativas; a mesma percentagem foi também verificada para o gene sigD. Pelo contrário, em aproximadamente 78% das condições analisadas, com diferenças de expressão significativas, o gene sigE apresenta um perfil diferente do encontrado nos genes de interesse, tal como acontece com sigB. Compilando a informação recolhida das bases de dados e a informação regulatória obtida através da análise de transcritoma, propõe-se neste trabalho um modelo de regulação para os genes pks1 e pks15, tendo por base uma abordagem conservativa em que se selecionou apenas os genes com total semelhança funcional e perfil transcricional. Foram, assim, selecionados os genes pks1, pks15 e fadD22, bem como os fatores σD, σK σB e σE. Os genes que codificam os fatores σD e σK encontram-se regulados negativamente em condições de hipoxia e latência, bem como na fase estacionária, sendo que o padrão contrário é verificado para os genes que codificam os fatores σB e σE. Além dos fatores σK e σE, previamente propostos como reguladores dos genes de interesse, propõe-se também que os fatores σB e σD estejam envolvidos na regulação de pks1, pks15 e fadD22. No futuro, será da maior relevância concluir as metodologias moleculares iniciadas no presente trabalho, tais como o estudo da atividade do promotor sob diversas condições de stress que mimetizam o ambiente do hospedeiro e a construção de um mutante de eliminação do gene pks1. Estas abordagens poderão contribuir para refinar o conhecimento da regulação transcricional dos genes pks1 e pks15, clarificar aspetos mecanísticos e a forma como a transcrição destes genes é articulada com redes de expressão globais e, assim, contribuir para o esclarecimento da função biológica exercida pelo produto destes genes na parede celular das micobactérias.

2018Master thesis

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Revisiting the expression signature of pks15/1 unveils regulatory patterns controlling phenolphtiocerol and phenolglycolipid production in pathogenic mycobacteria

Publication . Ramos, Beatriz; Gordon, Stephen V.; Cunha, Mónica V.

One of the most important and exclusive characteristics of mycobacteria is their cell wall. Amongst its constituent components are two related families of glycosylated lipids, diphthioceranates and phthiocerol dimycocerosate (PDIM) and its variant phenolic glycolipids (PGL). PGL have been associated with cell wall impermeability, phagocytosis, defence against nitrosative and oxidative stress and, intriguingly, biofilm formation. In bacteria from the Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC), the biosynthetic pathway of the phenolphthiocerol moiety of PGL depends upon the expression of several genes encoding type I polyketide synthases (PKS), namely ppsA-E and pks15/1 which constitute the PDIM + PGL locus, and that are highly conserved in PDIM/PGL-producing strains. Consensus has not been achieved regarding the genetic organization of pks15/1 locus and knowledge is lacking on its transcriptional signature. Here we explore publicly available datasets of transcriptome data (RNA-seq) from more than 100 MTBC experiments in 40 growth conditions to outline the transcriptional structure and signature of pks15/1, using a differential expression approach to infer the regulatory patterns involving these and related genes. We show that pks1 expression is highly correlated with fadD22, Rv2949c, lppX, fadD29 and, also, pks6 and pks12, with the first three putatively integrating into a polycistronic structure. We evidence dynamic transcriptional heterogeneity within the genes involved in phenolphtiocerol and phenolic glycolipid production, most exhibiting up-regulation upon acidic pH and antibiotic exposure and down-regulation under hypoxia, dormancy, and low/high iron concentration. We finally propose a model based on transcriptome data in which σD positively regulates pks1, pks15 and fadD22, while σB and σE factors exert negative regulation at an upper level.

2020-05-07Journal article

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