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Projeto de investigação
Optimization of P-glycoprotein modulators and insights into the efflux mechanism
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Terpenoids as effective compounds for overcoming multidrug resistance in cancer cells
Publication . Reis, Mariana; Ferreira, Maria José Umbelino, 1956-; Lage, Hermann
Circumventing multidrug resistance (MDR) in cancer is a cornerstone to chemotherapy success. Modulation of P-glycoprotein (P-gp) and evaluation of the collateral sensitivity effect are among the most promising approaches to overcome MDR. The main goal of this work was to explore these two approaches in order to find and optimize new MDR reversers derived from Euphorbia species. The phytochemical study of E. piscatoria yielded four new diterpenes, two with the ent-abietane skeleton (1-2) and two macrocyclic lathyranes (3-4). From E. welwitschii four new jatrophanes (19-22) were obtained. Welwitschines A (19) and B (20) present a unique combination of structural features: a 5/8/8 fused-ring system and an 12,15-ether bridge. Several known terpenoids (5-10 and 23) and flavonoids (11-14, 24 and 25) were also isolated from these plants. Moreover, a small library of 27 macrocyclic lathyrane diterpenes (6.1-6.27), targeted for P-gp efflux modulation, was achieved by molecular derivatization of jolkinol D (6), isolated from E. piscatoria. This process was accomplished mainly by using several alkanoyl and aroyl anhydrides/chlorides as acylating agents. The chemical structures of the compounds were deduced from their physical and spectroscopic data (IR, MS, 1D and 2D NMR experiments). Additionally, the stereochemistry of compounds 19 and 20 was confirmed through X-ray crystallography. Piscatoric acid (2) was a key compound to give insights into the biogenetic pathway of ent-abietane lactones. In the same way, the isolation of compounds 19-22 allowed to propose the 12,17-cyclojatrophanes biogenesis. The MDR reversal activity of compounds 6, 6.1-6.27 and 19-23 was evaluated through combination of transport and chemosensitivity assays, using the mouse lymphoma MDR1-transfected cell model. The most relevant structure-activity relationships for derivatives 6.1-6.27 highlighted the importance of the aroyl moiety and its pattern of substitution for P-gp efflux modulation. Most of the derivatives revealed to interact synergistically with doxorubicin, by increasing its cytotoxic activity. The effects on P-gp ATPase were evaluated for the most potent derivative, jolkinoate P (6.15). This compound showed to interact with P-gp, exhibiting a profile related to compounds that inhibit its ATPase activity. In regard to the jatrophanes 19-23, the results indicated that high conformational flexibility of the twelve-membered ring of compounds 21-23 favored P-gp modulation, in contrast to the tetracyclic scaffold of compounds 19 and 20. Epoxiwelwitschene (22) displayed the highest modulatory effect and may act as a competitive modulator, as indicated by the ATPase activity assay. Drug combination experiments also corroborated the anti-MDR potential of these diterpenes due to their synergistic interaction with doxorubicin. The potential collateral sensitivity effect of compounds 1-6, 8, 19-24 and 6.1-6.27 was evaluated against gastric (EPG85-257), pancreatic (EPP85-181) and colon (HT-29) human cancer cells and their drug-selected counterparts, resistant to novantrone (RN) and to daunorubicin (RDB), using a proliferation assay. Compounds 6.11, 6.22, 22 and 23 were able to decrease aproximately 85% of the level of resistance of EPG85-257RDB cells, in comparison to parental cells. Compounds 6.11, 6.20, 22 and 23 also showed promising results in pancreatic cells, being able to reduce the levels of resistance in about 32 - 65%. The mechanisms of cell death were analyzed, using the annexin V/PI and active caspase-3 assays. It was verified that cell death occurred through caspase-dependent apoptosis. The structural optimization of the compounds with the lathyrane scaffold and isolation of the jatrophanes from E. welwitschii, provided the identification of some important structural requirements, leading to a more effective reversion of MDR. Thus, compounds 6.11, 6.15, 6.20, 6.22, 22 and 23 can be proposed as new lead candidates for the development of MDR reversal agents.
Pesquisa de compostos com atividade antiproliferativa de plantas medicinais africanas
Publication . Silva, Jorge Miguel Carvalho Sousa e; Ferreira, Maria José Umbelino; Duarte, Noélia Maria da Silva Dias
Este trabalho teve como principal objetivo a obtenção de novos compostos com atividade biológica, nomeadamente atividade antiproliferativa, a partir de plantas medicinais Africanas. Para tal seguiram-se duas abordagens diferentes: i) estudo fitoquímico de algumas frações do extrato metanólico de Zanthoxylum capense (Rutaceae); ii) derivatização do policarpol (3), um triterpeno tetracíclico isolado anteriormente, em grandes quantidades, de Cleistochlamys kirkii (Annonaceae).
O fracionamento do extrato metanólico das raízes de Z. capense foi efetuado através de várias técnicas cromatográficas, nomeadamente cromatografia em coluna, cromatografia em camada fina e cromatografia líquida de alta eficiência. Foram isolados e caracterizados nove compostos, nomeadamente dois fenilpropanoides, um dos quais é um composto novo designado por capensato (2.5.1) e a integrifoliolina (2.5.2), quatro alcaloides benzofenantridínicos, a tridecanoqueleritina (2.2.1), a 6-acetonildi-hidroqueleritrina (2.2.2), a arnotianamida (2.2.3) e a norqueleritrina (2.2.4), um triterpeno pentacíclico, o lupeol (2.3.1) e dois linhanos do tipo furofurano, a (−)-episesamina (2.4.1) e a (−)-sesamina (2.4.2).
Adicionalmente, preparou-se um pequeno grupo de compostos a partir do policarpol (3). A derivatização molecular deste composto incluiu a manipulação dos grupos hidroxilo em C-3 e C-15, através de reações de esterificação com anidrido acético e diferentes cloretos de acilo, obtendo-se cinco compostos diacilados (3.1 – 3.5). A reação de oxidação dos grupos hidroxilo do policarpol (3) originou um novo composto com grupos cetona em C-3 e C-15 (3.6). O composto 3.6 reagiu posteriormente com a hidroxilamina originando uma oxima em C-3 (3.7) que por sua vez foi esterificada dando origem a três novos derivados monoacilados (3.8 – 3.10).
As estruturas químicas dos compostos foram estabelecidas com base nos seus dados físicos e espectroscópicos (IV, espectrometria de massa, RMN unidimensional – 1H, 13C e DEPT e bidimensional –1H-1H-COSY, HSQC e HMBC).
Para avaliar a capacidade antiproliferativa dos compostos, foram realizados ensaios preliminares em células do carcinoma do colon humano (HT-29) pelo método de redução do tetrazólio (MTT).
A (−)-sesamina (2.4.2) foi o composto que apresentou maior atividade antiproliferativa, com 82% de perda de viabilidade celular, seguindo-se o alcaloide benzofenantridínico arnotianamida (2.2.3), com 69%. A (−)-episesamina (2.4.1), apenas com diferenças estereoquímicas em relação à (−)-sesamina (2.4.2), não apresentou atividade significativa na concentração testada.
O policarpol (3) apresentou uma atividade moderada provocando 59% de perda de viabilidade celular. Os derivados 3.1, 3.7 e 3.8 apresentaram apenas um ligeiro aumento da atividade em relação ao policarpol (3). A substituição dos grupos hidroxilo do policarpol (3) por grupos cetona (3.6) levou à perda de atividade, sugerindo a importância do grupo OH na molécula.
Development of a small library of bioactive compounds through isolation and molecular derivatization
Publication . Gomes, João Nuno da Silva; Ferreira, Maria José Umbelino; Duarte, Noélia Maria da Silva Dias
The present dissertation focuses on the phytochemical study of Euphorbia boetica Boiss. and Euphorbia pubescens Vahl (Euphorbiaceae) aerial parts in an attempt to find effective modulators for P-glycoprotein (P-gp) mediated multidrug resistance (MDR) in tumour cells.
The methanol extracts of both plants were fractioned by chromatographic techniques such as column chromatography, preparative thin layer chromatography and high-performance liquid chromatography (HPLC). From the methanol extract of E. boetica, one new premyrsinane-type diterpene with the unusual 5:7:6:3 fused ring system and a new acylation pattern, named euphomyrsinane A, two new tigliane-type diterpenes with new acylation patterns, named phorboboetirane A and phorboboetirane B along with four known macrocyclic diterpenes, premyrsinol-3-propanoate-5-benzoate-7,13,17-triacetate, euphoboetirane A, epoxyboetirane A and epoxyboetirane K were isolated. A known triterpene with the cycloartane skeleton, 24-methylenecycloartanol, and a phenolic compound, methyl gallate were also isolated. From the methanol extracts of E. pubescens, were obtained a known macrocyclic diterpene, euphopubescenol, and a known diterpenic lactone, helioscopinolide A.
Due to its biological activity and simple structure paired with the fact that it was isolated in large amounts, methyl gallate was derivatized, aiming at generating a small set of bioactive derivatives. In this way, taking into account that lipophilicity and the presence of nitrogen atoms are described to improve the ability to reverse MDR, three main steps were considered: i) methylation of the hydroxyl groups on the aromatic ring by reaction with dimethylsulfate, yielding methyl 3,4,5-trimethoxebenzoate; ii) reaction of methyl 3,4,5-trimethoxybenzoate with hydrazine yielding 3,4,5-trimethoxybenzohydrazide; iii) condensation of 3,4,5-trimethoxybenzohydrazide with aromatic aldehydes to obtain three derivatives bearing an imine moiety.
The chemical structures of the compounds were deduced from their physical and spectroscopic data, which included infrared spectroscopy, mass spectrometry and extensive one- (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) and two-dimensional (1H-1H-COSY, HMQC, HMBC, and NOESY) Nuclear Magnetic Resonance studies and by comparison with literature data.
Compostos com atividade antitumoral da planta africana Momordica balsamina L.: moduladores da glicoproteína-P
Publication . Silva, Cristina Isabel Duarte
A multirresistência farmacológica (MDR) tem sido apontada como um dos principais motivos para a ineficácia da quimioterapia no tratamento do cancro. Um dos fatores responsáveis pelo desenvolvimento de MDR é a sobre-expressão da glicoproteína-P (P-gp) nas células tumorais, levando ao aumento do efluxo do fármaco do interior para o exterior da célula.
Em estudos anteriores, os triterpenos do tipo cucurbitano demonstraram uma forte atividade como moduladores da P-gp em células tumorais multirresistentes. Neste sentido, este trabalho teve como principal objetivo a obtenção de uma pequena biblioteca de compostos ativos, resultantes do estudo fitoquímico do extrato metanólico das partes aéreas da planta Africana Momordica balsamina L. (Cucurbitaceae).
Do fracionamento do extrato metanólico, por processos cromatográficos, resultaram cinco compostos novos, com o esqueleto do cucurbitano, denominados balsacurbitriol (2.1), balsacurbepoxitol (2.2), ácido balsacurbitóico (2.3), balsacurbital (2.4) e balsacurbinol (2.5), e cinco compostos já descritos anteriormente com o mesmo esqueleto: karavilagenina C (1.92), karavilagenina A (2.6), karavilagenina B (2.7), kuguacina B (2.8) e kuguacina C (2.9) e o esteroide, 24-etil-5α-colesta-7,22,25-trien-3-ol (2.10). A oxidação da karavilagenina C (1.92) e do esteroide (2.10) originou os compostos 2.11 e 2.12, respetivamente. A atribuição das estruturas químicas dos compostos foi realizada através da análise dos seus dados físicos e espectroscópicos, que incluíram: infravermelho, espectrometria de massa e estudos de RMN unidimensionais (1H, 13C, DEPT) e bidimensionais (HMQC, HMBC, COSY e NOESY).
Os compostos (1.92 e 2.1-2.12) foram avaliados quanto ao seu efeito citotóxico e como moduladores da P-gp em células T L5178Y de linfoma de rato, transfetadas com o gene humano ABCB1, e em células do adenocarcinoma do colón humano multirresistentes, através do ensaio de acumulação da rodamina 123. A maioria dos compostos mostrou uma forte atividade moduladora da P-gp (FAR > 10) e uma interação sinérgica com o fármaco antitumoral doxorrubicina, o que corroborou o seu potencial como reversores de MDR.
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Fundação para a Ciência e a Tecnologia
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3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/QEQ-MED/0905/2012