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Genome-wide understanding of biofilm formation by Staphylococcus aureus isolates
Publication . Teixeira, Sara Maria Jesus; Cunha, Mónica Vieira
Staphylococcus aureus é um patobionte que coloniza a mucosa nasal e a pele de vários mamíferos,
incluindo o Homem. As estirpes comensais de S. aureus podem, em situações específicas, quebrar
barreiras naturais, ganhando acesso a tecidos mais profundos, e causando infeções com gravidade muito
variável.
Esta espécie possui uma notável diversidade metabólica, adaptabilidade ecológica, e resistência a
xenobióticos. Esta resiliência tem por base a formação de biofilmes. Grande parte das infeções
provocadas por S. aureus estão associadas a biofilmes, nos quais se desenvolvem subpopulações
persistentes que exibem tolerância a múltiplas drogas e se evadem da ação do sistema imunitário.
O processo de formação de biofilmes em S. aureus engloba vários determinantes genéticos
envolvidos na adesão e colonização de superfícies; o operão ica envolvido na produção de PIA,
importante para a matriz extracelular; outras adesinas que medeiam interações intercelulares
consolidando o biofilme; o operão agr associado à deteção de quórum; entre outros determinantes.
Embora, nos últimos anos, se tenha expandido o conhecimento sobre o processo de formação de
biofilmes em S. aureus, muitos aspetos permanecem por esclarecer, nomeadamente a base molecular
subjacente à heterogeneidade fenotípica observada neste domínio em isolados de diferentes origens.
Também pouco se conhece sobre os loci genéticos que estão sob pressão seletiva para a expressão do
fenótipo de biofilme. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi o de contribuir para o aumento do
conhecimento sobre as bases fenotípicas e genéticas da formação de biofilmes em Staphylococcus
aureus, através de uma abordagem integrada, combinando análise fenotípica, genómica comparativa e
evolução adaptativa experimental. Para o efeito, foram caracterizados 115 isolados de S. aureus obtidos
de animais selvagens, javali (n = 68), veado-vermelho (n = 36) e gamo (n = 11), em seis locais de
amostragem. Os isolados foram comparados na sua capacidade de formação de biofilme in vitro após
crescimento, durante 48 horas a 37 ºC, em microplacas de 24 poços contendo meio de cultura MuellerHinton (MH), sem agitação. Os 115 isolados foram classificados em três categorias: fracos produtores
de biofilme (WBP, 9.57% dos isolados), produtores moderados de biofilme (MBP, 76.52%) e produtores
fortes de biofilme (SBP, 13.91%).
Registou-se que, dos 115 isolados, os isolados multirresistentes apresentavam produção média de
biofilme significativamente maior quando comparada aos grupos suscetível e resistente. Após
sequenciação completa do genoma dos 115 isolados, classificou-se in silico cada isolado no seu genótipo
spa-type e no perfil alélico gerado por Multilocus sequence typing (MLST), com o objetivo de explorar
eventuais correlações entre o genótipo e o fenótipo (i.e. formação de biofilme).
Nas condições estudadas, verificou-se que os isolados com spa-type t034 produzem
significativamente maior quantidade de biofilme em comparação com a maioria dos isolados doutros
spa-types. Os isolados com spa-type t3583 e t701 foram associados a reduzida formação de biofilme.
Em contraste, os isolados com perfil alélico (sequence-type) ST6133, associados ao spa-type t034 e
complexo clonal CC398, destacam-se dos restantes, devido à sua forte capacidade de produção de
biofilme.
Apesar da literatura descrever que os operões agr e ica desempenham papéis essenciais no
processo de formação de biofilmes, neste trabalho não se registaram correlações significativas entre a
quantidade de biofilme formado e os quatro grupos de agr existentes. Apenas os isolados do agr-type I
apresentaram menor produção de biofilme (diferenças estatisticamente não significativas). Quando se
comparou o posicionamento filogenético dos isolados pertencentes às duas categorias extremas de produção de biofilme (fracos e fortes produtores de biofilme), não se registaram grupos monofiléticos,
quando se examinou as sequências concatenadas do operão ica, ou do operão agr.
Para aferir a base genética subjacente a diferentes fenótipos de formação de biofilmes, explorouse abordagens de genómica comparativa dos 115 isolados, focando especificamente as sequências de 15
genes anteriormente associados na literatura ao processo de desenvolvimento do biofilme. A análise
filogenética dos isolados resultante do alinhamento das sequências concatenadas dos 15 genes não
segregou os isolados SBP dos isolados WBP, apenas evidenciou que o posicionamento filogenético dos
isolados é determinado pelo seu perfil alélico MLST (grupos monofiléticos). Os perfis alélicos ST5,
ST3224 e ST6133 apresentavam exclusivamente isolados SBP, enquanto o ST72 estava associado
apenas a isolados WBP. Os polimorfismos encontrados nestes 15 loci foram analisados com maior
detalhe para identificar variantes exclusivas (ou mais frequentes) de SBP. Comparando-se os
polimorfismos encontrados em, pelo menos, 40% dos isolados WBP e dos isolados SBP, foram
encontradas 50 variantes potencialmente relevantes para descrever o fenótipo de formação de biofilme.
Estas mutações estavam presentes em 9 dos 15 genes selecionados. As mutações foram mais frequentes
nos genes fnbA, ebpS e clfA, que codificam adesinas, associadas às primeiras etapas de formação de
biofilme (adesão). Os genes icaB e icaC mutados em isolados de SBP podem afetar positivamente a
produção de PIA.
Paralelamente, foi aplicada uma metodologia de evolução adaptativa experimental (ALE) para
selecionar artificialmente isolados com maior produção de biofilme, seguida de sequenciação do
genoma dos isolados evoluídos, visando explorar as variantes genómicas emergentes. Os isolados de S.
aureus ST0563 e ST0719 (WBP) e ST0645 (SBP) foram selecionados para este estudo. O ensaio
estabelecido promoveu ciclos de recolonização e dispersão do biofilme. Nas duas linhagens dos isolados
WBP, registou-se um aumento consistente da capacidade de formação de biofilme dos isolados
amostrados semanalmente, independente da presença da esfera. Nas linhagens do isolado ST0645 não
foi observado o mesmo aumento. A análise assente em genómica comparativa evidenciou que a maioria
dos polimorfismos acumulados nos isolados evoluidos são SNPs, dos quais mais de 50% correspondem
a alterações missense com elevado impacto. Nos isolados evoluídos das linhagens ST0563 foram
encontradas variantes nos genes mraY, purR, ebh, nrnA, agrA, esaA e apt. Nos isolados evoluídos de
ST0645 foram encontradas mutações nos genes apt, saeR, saeS e arlS. Por último, nos isolados
evoluídos das linhagens de ST0719 foram encontrados polimorfismos nos genes purR, copA, pbuG,
clpC, purA, pepF1_1, fadR, tarS, bem como nos genes cujos produtos são uma proteína PhoH-like e
uma farnesil difosfato sintetase. A biogénese da membrana/envelope e transcrição foram as categorias
funcionais COG das variantes associadas a um maior impacto (cerca de 600% de aumento) na formação
de biofilme deste estudo. Por outro lado, detetaram-se variantes em loci associados a transdução de
sinal e ao transporte e metabolismo de nucleótidos nos isolados evoluídos nos quais se registou um
aumento de biofilme de 300% e 400%, respetivamente.
Foram também conduzidos ensaios de ALE para selecionar artificialmente isolados com maior
tolerância ao linezolide (antibiótico de importância crítica). Este ensaio teve por objetivo explorar as
variantes genómicas de isolados evoluídos com foco no aumento da concentração mínima inibitória
(MIC) e o impacto subjacente à formação de biofilmes. A estirpe S. aureus ATCC 25923 foi sujeita a
ciclos de exposição a elevadas concentrações de linezolide (20x a MIC) durante 7 ou 14 dias de
tratamento. Durante este período, registou-se uma ligeira diminuição da viabilidade celular nas três
linhagens evoluídas. Ao longo do ensaio, diminuiu o número de bactérias com a MIC original (MIC =
4 mg/L). Na Linhagem 1, obteve-se três isolados nos quais se registou o aumento em quatro vezes da
MIC (MIC = 16 mg/L); na Linhagem 2, apenas um isolado; e, na Linhagem 3, também três isolados.
Para quantificação do biofilme produzido, foram selecionados todos os isolados de todas as linhagens com MIC = 16 mg/L, e todos os isolados obtidos nos dias 7 e 14 que apresentavam MIC = 8 mg/L. Não
se registaram variações significativas na quantidade de biofilme formado pelos isolados evoluídos, por
comparação com o isolado parental. Em contraste, dois isolados da Linhagem 1 apresentaram redução
significativa da formação de biofilme. Sequenciou-se o genoma completo de alguns dos isolados
resistentes de cada linhagem que apresentavam maior produção de biofilme. Foram identificados sete
polimorfismos nos isolados selecionados das Linhagens 1 e da 2, enquanto na Linhagem 3, sujeita a
menos ciclos de exposição a linezolide (sete dias) registou-se apenas um polimorfismo com efeito
sinónimo numa proteína hipotética. A maioria dos outros polimorfismos encontrados são SNPs, a
maioria com efeito missense. Foram encontradas mutações nos genes nanE, fadR, atl_2, mdrP_1, apt e
ogt. Variantes genómicas nas categorias funcionais COG transporte e metabolismo de carbohidratos
foram associadas a maior impacto na quantidade de formação de biofilmes dos isolados evoluídos,
tendo-se registado uma diminuição drástica da quantidade de biofilme (superior a 60%), quando
comparada com o biofilme original. Por outro lado, e em linha com o ensaio ALE anterior, variantes
categorizadas na função transcrição, foram detetadas em isolados evoluídos nos quais se registou um
aumento (25%) na quantidade de biofilme produzido.
Em suma, neste trabalho, verificou-se que a especialização para o crescimento em biofilme ocorre
rapidamente, com alterações genómicas várias e complexas, em associação com a remodelação de
determinantes da adesão e da matriz extracelular, bem como a acumulação de polimorfismos em efetores
de diferentes níveis de regulação. Foram identificados vários genes com um papel putativo na formação
de biofilmes que poderão ser explorados no futuro como biomarcadores deste fenótipo e potenciais alvos
terapêuticos.
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Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
2022.01539.PTDC