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The impact of Lama2-deficiency on cell cycle regulation and survival
Publication . Melo, Catarina Elisa Mineiro de; Carlos, Ana Rita Cabral Martins
Laminin α2 chain-deficient congenital muscular dystrophy (LAMA2-CMD) is caused by
recessive mutations in the LAMA2 gene. This neuromuscular disease is diagnosed at birth or within the
first few months of life and is characterized by hypotonia and severe muscle weakness. Using the dyW
mouse model of LAMA2-CMD, previous studies by the host laboratory showed that the onset of this
muscular dystrophy occurs in utero, more specifically between embryonic days 17.5 and 18.5 (E17.5-
E18.5), where it is observed a reduction in the size of muscle fibers and lower expression of the
myogenic factors Pax7 and Myogenin. These alterations may be related to changes in cell cycle and cell
survival regulation, as revealed by the overactivation of the transcription factor STAT3 and increased
expression of the respective target gene Pim1. To investigate how Lama2-deficiency impacts on cell
cycle regulation and survival, we used RT-qPCR and Western Blot to analyze the expression of genes
and proteins involved in different cell fate pathways, comparing epaxial muscles of wildtype (wt) and
dyW mice at E17.5 and E18.5. We also generated C2C12 myoblast cell lines deficient for Lama2 and
for both Lama2 and p53, a master transcription regulator of cell cycle and survival. Using these in vitro
models, pathways linked to proliferation/cell cycle were analyzed by RT-qPCR, immunofluorescence
and Resazurin assay. Our results suggest a difference in genes linked to cell cycle regulation,
proliferation, autophagy and senescence. C2C12 Lama2 knockouts revealed a decrease in proliferation,
possibly explained by cell cycle arrest at G1/G0 phase, which was partially rescued by the co-deletion
of Lama2 and p53. This work highlighted alterations in terms of cell fate regulation, involved in LAMA CMD onset, and resulted in the generation of an in vitro model, both important to gain further
mechanistic insights about this disorder and to develop efficient therapies.
How Lama2-deficiency impacts myoblast differentiation in a mouse model for LAMA2-congenital muscular dystrophy
Publication . Ribeiro, Vanessa Filipa Laranjeiro; Thorsteinsdottir, Sólveig; Carlos, Ana Rita
A matriz extracelular (MEC) é uma complexa rede acelular presente em todos os tecidos e fornece
um suporte físico para as células. Embora a sua composição seja variável e especifica dependendo
do tecido, os principais constituintes são água, glicoproteínas (como colagénios, fibronectina e
laminina), elastina, proteoglicanos e hialurano, que conjuntamente com outros componentes se
designam de matrissoma. Existem dois tipos principais de MEC, a matriz intersticial de estrutura
fibrosa ou semelhante a gel e a membrana basal que está em contacto com as células. A MEC tem
a função de estabilização de células e tecidos, fornecendo substratos de adesão celular em fase
sólida e ligando a MEC ao citoesqueleto das células via recetores transmembranares. A MEC
desempenha também um papel chave como reservatório de fatores de crescimento e moléculas
bioativas que controlam os comportamentos e características fundamentais das células como
sinalização, proliferação, adesão, migração, polaridade, diferenciação e apoptose. Mutações nos
componentes da MEC, nas proteínas transmembranares ou em proteínas que liguem a MEC ao
citoesqueleto das células musculares esqueléticas podem levar a distrofias musculares. As
distrofias musculares congénitas representam um grupo de doenças que causam fraqueza
(hipotonia) e atrofia muscular, sendo detetadas logo, ou pouco após a nascença. Estas são doenças
geralmente hereditárias e associadas a mutações autossómicas recessivas. A distrofia muscular
associada ao gene LAMA2 (LAMA2-CMD) é a distrofia muscular congénita mais comum e esta
doença neuromuscular, tal como o nome indica, é desencadeada por mutações no gene LAMA2,
que codifica para a cadeia α2 das lamininas 211/221, levando à redução da força muscular e a
constrangimentos na regeneração muscular, sendo que atualmente não existe cura para esta
doença. A ausência desta proteína leva a danos nas miofibras e a tentativa de reparação deste dano
por regeneração, através das células estaminais musculares adultas (células satélite), não ocorre
com sucesso. As fibras musculares entram em degeneração através da indução de apoptose, que
é seguida de regeneração e inflamação crónica, e como consequência o tecido muscular é
substituído por tecido fibrótico e adipócitos. Estudos anteriores do laboratório utilizando a estirpe
de ratinho dyW, a qual é um dos modelos mais utilizados para o estudo de LAMA2-CMD, sugerem
que a laminina 211 desempenha um papel importante durante o desenvolvimento e crescimento
muscular normais durante o período fetal. Em particular, os resultados mostraram que entre os
dias embrionários (E)17.5 e E18.5, portanto durante o período fetal, o número de células
musculares estaminais (células Pax7 positivas) e mioblastos diferenciados (células miogenina
positivas) torna-se reduzido em fetos dyW, em comparação com os controlos e verifica-se um
atraso no crescimento muscular. Contudo, desconhece-se que mecanismos causam esta redução
no crescimento muscular, que vias de sinalização são afetadas e se a proliferação e/ou
diferenciação das células estaminais musculares esqueléticas e mioblastos são afetadas.
Um dos objetivos deste projeto é compreender se a diferenciação de mioblastos está afetada na
ausência de Lama2, e quais as vias envolvidas. Para tal foi utilizada uma linha celular de
mioblastos, C2C12, na qual o gene Lama2 se encontra mutado, com o objetivo de estabelecer um
modelo in vitro para LAMA2-CMD que pudesse ser utilizado para responder a esta questão. A
análise de células mutadas para Lama2 permitiu revelar que a formação de miotubos fica
comprometida nesta linha celular em comparação com a linha celular selvagem. Tendo feito esta
observação, fulcral para o projeto, seguiu-se então o estudo de quais as vias responsáveis pelo
defeito na diferenciação. Conhecida por ser responsável pela transição entre a miogénese
embrionária e fetal, a via do Nfix foi um dos focos da análise das vias que afetam a diferenciação
dos mioblastos, assim como a via da miogenina, que leva à diferenciação terminal dos mioblastos
e a via Jak-Stat3, a qual desempenha um papel duplo na proliferação e diferenciação dos
mioblastos.
Os dados obtidos in vitro sugerem um aumento significativo dos níveis de expressão da proteína
Nfix e uma diminuição dos níveis de expressão do gene Myog, que codifica para a miogenina,
bem como uma desregulação na expressão génica dos genes alvo de ambas as proteínas. Os dados
in vivo sugerem uma tendência para uma diminuição da expressão do gene Myog em amostras de
musculo epaxial de ratinhos dyW e uma tendência para um aumento da expressão do gene Nfix no
estádio E17.5, assim como uma desregulação na expressão dos seus genes alvo. No estádio E18.5 os dados sugerem uma tendência para uma diminuição da expressão do gene Nfix em amostras de
músculo epaxial de ratinhos dyW. O eixo de sinalização RhoA/ROCK-Erk foi descrito como
sendo importante na ativação do Nfix, e a proteína FAK como sendo importante para a
diferenciação dos mioblastos através da ativação do fator regulatório miogénico MyoD e por isso
estes fatores foram igualmente alvo de análise in vitro. Os níveis de expressão de P-FAK e P-Erk
mostram uma tendência para aumento in vitro na ausência do gene Lama2, assim com in vivo, em
amostras de musculo epaxial de ratinhos dyW, no estádio E17.5. Tendo em conta estudos recentes
e os resultados obtidos de aumento da expressão de Nfix na ausência de Lama2, coloca-se a
hipótese de que o aumento dos níveis de Nfix se deva a uma tentativa de controlo da sobrexpressão
da proteína miostatina, a qual inibe a miogénese através da inibição da expressão de Myf5, um
fator miogénico importante para o processo de diferenciação. Coincidente com a diferenciação
comprometida nas linhas celulares C2C12 com o gene Lama2 silenciado, verificou-se uma
retenção significativa de Myf5 no citoplasma comparando com as células musculares C2C12
selvagens. Contudo é necessário validar no futuro os níveis de expressão génica e proteica da
miostatina.
Como mencionado, a via Jak-Stat tem um papel importante na diferenciação dos mioblastos e os
resultados obtidos mostram um aumento significativo da expressão da proteína de P-Stat3 in vitro,
assim como uma tendência para um aumento in vivo no estadio E.17.5. Tal está de acordo com
estudos anteriores do laboratório que mostraram um aumento de P-Stat3 no musculo fetal de
ratinhos dyW, no estádio E17.5.
Os dados obtidos indicam que a laminina 211 desempenha normalmente um papel na modulação
da diferenciação dos mioblastos e a sua ausência leva á desregulação de algumas das vias
importantes para a proliferação e diferenciação dos mioblastos. Os resultados sugerem também
que a linha celular de mioblastos C2C12 sem o gene Lama2, pode ser um bom modelo in vitro
para LAMA2-CMD, tendo em conta a semelhança com os resultados obtidos in vivo, em
particular para as amostras de ratinho dyW, no estádio E17.5.
Um outro objetivo deste projeto foi verificar o impacto da ausência de LAMA2 em linhas celulares
tumorais de melanoma e cancro colorectal, uma vez que ambas foram descritas como tendo
alterações na expressão de LAMA2. Tendo sido descrito como significativamente expresso em
melanoma e cancro colorectal e promover a proliferação e migração, o gene ENO1 que codifica
para a enolase alfa foi analisado e verifica-se uma tendência para diminuição de expressão nas
linhas tumorais de melanoma, o que poderá indicar que na ausência de LAMA2, há uma
diminuição na proliferação e migração. Tendo em conta os resultados obtidos nas células
musculares esqueléticas verificou-se também os níveis de expressão da proteína P-Stat3 para a
linha tumoral colorectal e verifica-se igualmente uma tendência para um aumento da sua
expressão, na ausência de LAMA2. Os dados sugerem um ponto chave na ausência de LAMA2 nas
MEC, sendo que independentemente do tipo celular e da doença há um aumento da expressão da
proteína P-STAT3 quando há ausência da Laminina 211/221.
Identificar estas vias e mecanismos é essencial para o desenvolvimento de terapias que tenham
como alvo direto o início destas doenças.
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Financiadores
Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/BTM-ORG/1383/2020