A carregar...
Projeto de investigação
Sem título
Financiador
Autores
Publicações
Development of carriers for insulin delivery for wound healing applications
Publication . Mendes, Francisca Ribeiro; Fonte, Pedro Ricardo Martins Lopes da; Ferreira, Hugo Alexandre Teixeira Duarte
A prevalência de feridas crónicas representa um dos maiores problemas de saúde pública a nível global, em função dos longos períodos de cicatrização associados a tratamentos pouco eficazes. A cicatrização de feridas é um processo fisiológico dinâmico e organizado que permite a recuperação da integridade da pele após uma lesão. Assim, a interrupção deste processo está associada a um impacto negativo e significante na qualidade de vida dos pacientes. Pacientes com patologias como a diabetes e obesidade estão mais sujeitos ao aparecimento deste tipo de feridas, devido a condições inerentes de hiperglicemia e complicações cardiovasculares. A idade é também um fator de risco para este tipo de lesão. Ao longo das últimas décadas equipas de investigação têm-se dedicado à descoberta de novas terapias, sendo que a principal abordagem para este tipo de patologia consiste em eliminar o foco de inflamação e aplicar topicamente fatores de crescimentos exógenos. A insulina é um fator de crescimento com um preço reduzido e vastamente disponível no mercado, capaz de estimular a migração celular, acelerando o processo de cicatrização. Contudo, a eficácia da administração tópica de insulina torna-se reduzida devido à ação das protéases presentes no leito da ferida. Assim, torna-se fundamental desenvolver novos métodos eficazes e capazes de contrariar este efeito proteolítico, protegendo o fator de crescimento da degradação. A encapsulação da insulina em micropartículas é capaz de conferir estabilidade à proteína quando administrada na ferida, promovendo uma libertação controlada e uma maior adesão às superfícies mucosas. Estudos revelaram, também, que a administração tópica de células estaminais mesenquimais acelera o processo de cicatrização, promovendo a formação de novos vasos sanguíneos num processo designado angiogénese, e reduzindo a inflamação. Este tipo de células estaminais têm a capacidade de se autorrenovarem em diferentes linhagens celulares, secretar fatores de crescimento e outras biomoléculas. Para além disso, o secretoma destas células é capaz de promover a deposição de matriz extracelular e aumentar a estabilidade dos fatores de crescimento no leito da ferida. Por outro lado, os fatores de crescimento têm, também, influência ao nível da modulação do efeito destas células estaminais. Assim, a co-encapsulação de insulina em conjunto com células estaminais mesenquimais em micropartículas pode ser uma estratégia inovadora no campo da medicina regenerativa, com aplicação na regeneração de feridas crónicas. Relativamente à administração destes fatores terapêuticas, esta pode ser feita através de aplicação de hidrogéis, capazes de conferir proteção contra a degradação provocada pelo ambiente. O PVA é um polímero sintético solúvel em água frequentemente utilizado na produção de hidrogéis, que pode ser reticulado de modo a adquirir excelentes propriedades viscoelásticas. Os hidrogéis compostos por este polímero conferem à pele uma camada resistente ao stress provocado pelo processo de cicatrização, promovendo uma sensação de conforto quando são aplicados na ferida. Por outro lado, o alginato é um polímero natural conhecido pela sua capacidade de absorver os fluídos em excesso existentes nas feridas, mantendo a hidratação da pele. Também a glicerina é frequentemente utilizada em hidrogéis, funcionado como emoliente e conferindo estrutura ao mesmo. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho é desenvolver um hidrogel com nanopartículas contendo insulina, através de ciclos de congelação-descongelação. Posteriormente, é necessário otimizar este hidrogel que deverá ser apto para aplicação tópica, promovendo uma sensação de conforto quando aplicado na ferida. Para isso, as suas propriedades reológicas, tais como a viscosidade, vão ser avaliadas de modo a garantir a obtenção de um sistema de administração de insulina apto para aplicação em feridas crónicas. Para proceder à caracterização e produção deste hidrogel foram utilizadas nanopartículas revestidas com quitosano previamente produzidas pelo grupo de investigação que foram depois incorporadas no hidrogel composto por PVA, alginato e glicerina. Note-se que as nanopartículas revestidas com quitosano foram apenas utilizadas para estudar as propriedades reológicas do hidrogel, de modo a otimizar a sua formulação. Nesta primeira fase foi possível estudar e compreender a influência das variáveis independentes (percentagem de quitosano, alginato e glicerina, e número de ciclos de congelação-descongelação) nas propriedades do sistema composto pelo hidrogel e nanopartículas. A variável com maior impacto sobre as características do hidrogel é a quantidade de alginato, que influencia propriedades como a viscosidade e o potencial zeta. Correlacionando estes fatores tornou-se, então, possível, determinar a formulação ideal para o hidrogel. Numa segunda fase do projeto, pretende-se desenvolver um sistema para co-encapsulação de insulina com células estaminais mesenquimais através da técnica de microfluídica. Neste caso, o objetivo é estudar a estrutura da insulina após encapsulação, para mais tarde adicionar à formulação as células estaminais mesenquimais. A microfluídica foi a técnica escolhida para este efeito, uma vez que permite uma rápida produção de micropartículas com um tamanho e forma bem definidos, bem como a encapsulação de células em simultâneo. Assim, produziu-se um microchip com uma estrutura em forma de “T” e utilizaram-se propulsores de seringas para administrar duas fases imiscíveis com um fluxo constante. A fase contínua corresponde a uma solução de alginato e insulina, enquanto a fase dispersa corresponde a uma solução lipídica auto-emulsionante. Neste contexto, as partículas produzidas têm dimensões entre 10-100 µm, pelo que são consideradas micropartículas. Com o objetivo de otimizar a produção de micropartículas, produziram-se microchips com entradas e saídas reforçados para evitar pequenas fugas de conteúdo provocadas pela textura oleosa da fase dispersa. Apesar de eficaz, a técnica de microfluídica é bastante minuciosa, na medida em que é necessário determinar os fluxos ideias para um cada dos fluídos, possibilitando a formação de partículas esféricas. Para efeitos de controlo, foram produzidas partículas com e sem insulina. Uma vez produzidas, as partículas foram congeladas e posteriormente liofilizadas, com e sem crioprotetor. A morfologia da superfície das micropartículas foi avaliada através da técnica de microscopia eletrónica de varredura, e foram também realizados ensaio de libertação durante um período de 48 horas para avaliar e eficácia do sistema. A insulina foi depois extraída das micropartículas e a sua estrutura foi avaliada por microscopia de fluorescência, dicroísmo circular, espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier, e ensaios de Tio Flavina-T. Os resultados obtidos com o ensaio de libertação revelaram uma libertação uniforme e controlada de insulina durante as 48 horas, permitindo concluir que esta libertação poderá manter-se mesmo após este período. Os resultados de dicroísmo circular e microscopia de fluorescência revelaram que a insulina manteve a sua estrutura após encapsulação, com presença de apenas pequenas alterações. Os resultados de espetroscopia de infravermelho com transformada de Fourier confirmaram que a estrutura da insulina foi conservada após encapsulação, e não foram detetadas novas interações da proteína com o alginato. Os resultados obtidos relativamente às partículas congeladas com e sem crioprotetor revelaram-se semelhantes, sem grandes diferenças a notar relativamente a esta variável. Os resultados obtidos com este trabalho sugerem que a insulina pode ser eficazmente encapsulada através da técnica de microfluídica. Assim, reúnem-se condições para aliar os resultados obtidos em ambas as etapas deste trabalho, sendo que o produto final seria um hidrogel cuja formulação foi otimizada, contendo micropartículas com insulina, obtidas com recurso à técnica de microfluídica. Futuramente, pretende-se desenvolver um microchip com maior complexidade que permita encapsular as células estaminais mesenquimais em simultâneo com a insulina. Assim, será possível avaliar a viabilidade das células após encapsulação, bem como estudar a citotoxicidade e bioatividade da formulação in vitro. O resultado final será uma plataforma multipotente para administração tópica de fatores de crescimentos células estaminais mesenquimais para a cicatrização de feridas crónicas.
Unidades organizacionais
Descrição
Palavras-chave
Contribuidores
Financiadores
Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
9471 - RIDTI
Número da atribuição
PTDC/MEC-DER/32610/2017