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Nonlinear emission of quinolizinium-based dyes with application in fluorescence lifetime imaging
Publication . Marcelo, Gema; Pinto, Sandra; Cañeque, Tatiana; Mariz, Inês F. A.; Vaquero, Juan J.; Martinho, J. M. G.; Maçôas, Ermelinda; Cuadro, Ana M.
Charged molecules based on the quinolizinum cation have potential applications as labels in fluorescence imaging in biological media under nonlinear excitation. A systematic study of the linear and nonlinear photophysics of derivatives of the quinolizinum cation substituted by either dimethylaniline or methoxyphenyl electron donors is performed. The effects of donor strength, conjugation length, and symmetry in the two-photon emission efficiency are analyzed in detail. The best performing nonlinear fluorophore, with two-photon absorption cross sections of 1140 GM and an emission quantum yield of 0.22, is characterized by a symmetric D-π-A(+)-π-D architecture based on the methoxyphenyl substituent. Application of this molecule as a fluorescent marker in optical microscopy of living cells revealed that, under favorable conditions, the fluorophore can be localized in the cytoplasmatic compartment of the cell, staining vesicular shape organelles. At higher dye concentrations and longer staining times, the fluorophore can also penetrate into the nucleus. The nonlinearly excited fluorescence lifetime imaging shows that the fluorophore lifetime is sensitive to its location in the different cell compartments. Using fluorescence lifetime microscopy, a multicolor map of the cell is drafted with a single dye.
Impact of calcium on PI(4,5)P2: protein interactions and membrane organization
Publication . Araújo, Luís Pedro Borges; Fernandes, Fábio; Coutinho, Ana Isabel Abrantes,1965-
PI(4,5)P2 é um importante fosfoinositol, localizado no folheto interno das células eucariotas, que possui um grupo inositol hidrófilo, carregado negativamente. As características biofísicas particulares do PI(4,5)P2 permitem que este consiga recrutar, regular e interagir com várias proteínas sinalizadoras. Este fosfolípido tem um papel central na regulação da dinâmica da membrana plasmática, em eventos como a exocitose e a endocitose, participa como substrato na produção de segundos mensageiros em vias de sinalização, como a catalisada pelo fosfolipase C, sendo ainda um componente crucial na promoção do recrutamento de proteínas para o folheto interno da membrana plasmática. A interação de catiões divalentes, especialmente o cálcio, com PI(4,5)P2, tem sido o foco de vários estudos. O cálcio é um catião divalente, com uma concentração intracelular baixa e altamente regulada. Este catião desempenha um papel crucial como elemento nas cascatas de transdução de sinal e como cofator importante para o funcionamento de várias proteínas. O grupo inositol fosforilado do PI(4,5)P2 participa em fortes interações electroestáticas com catiões divalentes, induzindo a formação de micro domínios (clusters) de PI(4,5)P2 e influenciando a sua distribuição de carga. Este efeito é observado mesmo em concentrações fisiológicas de PI(4,5)P2 e cálcio. No entanto, o impacto dos catiões divalentes na interação de PI(4,5)P2 com as proteínas às quais este se liga e através das quais este participa em várias vias de sinalização, só recentemente tem sido alvo de estudo. De modo a aprofundar os conhecimentos nesta área, neste trabalho estudámos dois modelos proteicos com a capacidade de se ligarem a PI(4,5)P2 através de diferentes mecanismos, PH-YFP e PBP-10. PH-YFP é uma proteína de fusão que consiste num domínio YFP, com a capacidade de dimerizar, ligado a um domínio PLCδ1-PH. O domínio PLCδ1 PH liga-se ao PI(4,5)P2 com elevada afinidade e especificidade, através do reconhecimento estereoespecífico do grupo hidrófilo do PI(4,5)P2. O PBP-10, por sua vez, é um péptido policatiónico que interage com o PI(4,5)P2 através de interações electroestáticas não especificas. Utilizando uma combinação de métodos de espectroscopia e de microscopia confocal de fluorescência, utilizámos estes dois modelos proteicos de modo a determinar a influência de concentrações fisiológicas de cálcio nas interações PI(4,5)P2– proteína e na organização membranar das proteínas ligantes de PI(4,5)P2. Os estudos iniciais realizados com PH-YFP, confirmaram, através de ensaios de polarização de fluorescência e de histograma de contagem de fotões (PCH), que o PH-YFP dimeriza na membrana. No entanto, na presença de 100 μM Ca2+, esta dimerização é inibida reversivelmente. Este efeito não se deve a uma menor concentração da proteína associada às membranas pois é observado mesmo na presença de concentrações saturantes de lípido. Por outro lado, os resultados obtidos por espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) mostram que o PH-YFP difunde na membrana de forma significativamente mais lenta na presença de cálcio, confirmando que esta proteína se liga e permanece associada aos clusters de PI(4,5)P2 formados a estas concentrações. A inibição da dimerização de PH-YFP na membrana, na presença de cálcio, pode ser explicada através de um modelo em que os clusters de PI(4,5)P2 são suficientemente pequenos para tornar improvável a associação de mais que um PH-YFP em simultâneo no mesmo cluster, efetivamente diminuindo a probabilidade de ocorrência de interações proteína-proteína na membrana. Neste modelo, a agregação de PI(4,5)P2 por cálcio, promove um “sequestro” de proteínas com afinidade para este fosfolípido, diminuindo a disponibilidade destas para estabelecer interações com outros componentes membranares. Utilizando a técnica de PCH, foi possível quantificar ainda a oligomerização de PH-YFP, confirmando-se que esta é dependente da concentração de cálcio. A 20μM de Ca2+, a fração de proteína oligomerizada, que fora detetada na ausência de cálcio, é praticamente nula. No entanto, a 50μM Ca2+ e 100μM Ca2+ é detetada uma ligeira recuperação desta população. Esta observação parece sugerir que o tamanho dos clusters de PI(4,5)P2 aumentam com a concentração de cálcio, permitindo a incorporação de várias proteínas no mesmo domínio e consequente oligomerização. No entanto, é necessário realizar estudos adicionais de modo a caracterizar este mecanismo mais detalhadamente. O conjunto destes resultados sugere que, in vivo, este mecanismo poderá afetar uma variedade de proteínas, podendo atuar como um “interruptor”, inibindo ou promovendo a interação entre proteínas. Usando microscopia confocal de fluorescência, determinámos ainda que a afinidade de PH-YFP para com GUVs contendo PI(4,5)P2, varia também com a concentração de cálcio. Foi observada uma resposta bifásica em que até 100μM Ca2+ se deteta um aumento da afinidade de PH-YFP. No entanto, para concentrações mais elevadas de cálcio, a afinidade diminui para níveis ligeiramente mais baixos do que na ausência do catião. A maior afinidade da proteína para membranas a baixas concentrações de Ca2+, coincide com a formação de clusters de PI(4,5)P2 e por isso poderá ser resultado de uma alteração de conformação ou exposição do grupo hidrófilo do PI(4,5)P2 quando incluído nestes agregados. Por outro lado, a diminuição da afinidade do PH-YFP para membranas a concentrações elevadas de PI(4,5)P2, estará muito provavelmente associada a um efeito de blindagem de carga ao PI(4,5)P2 pelo cálcio, que interfere nas interações electroestáticas com o PH-YFP. Nos estudos realizados com o péptido PBP-10, analisou-se o efeito do cálcio na partição do péptido para as membranas lipídicas, usando métodos de espectroscopia de fluorescência. Na presença de 100 μM Ca2+, observámos uma redução para metade no coeficiente de partição do péptido para LUVs contendo 5% PI(4,5)P2. Esta redução não foi observada quando se testaram LUVs contendo 20% PS, mantendo-se a densidade de carga média da superfície da membrana. Estes resultados sugerem que a partição do PBP-10 estará a ser afetado pelo efeito de blindagem de carga pelo cálcio ao PI(4,5)P2, tal como observado para PH-YFP a concentrações superiores a 100 μM Ca2+. Uma vez que na interação entre PBP-10 e PI(4,5)P2, as contribuições electrostáticas são dominantes para definir a afinidade entre as moléculas, o efeito inibidor do cálcio ocorre a concentrações mais baixas.
Estudos subsequentes de FRET sobre a interação do PBP-10 com derivados fluorescentes dos dois componentes individuais dos modelos de membrana usados nestes estudos (TF-PI(4,5)P2 e Bodipy-PC), na presença e ausência de cálcio, confirmaram a diminuição da interação do péptido com o PI(4,5)P2. Estes dados estão de acordo com a hipótese da blindagem de carga pelo cálcio ao PI(4,5)P2. Experiências controlo de FRET confirmaram que não houve uma diminuição significativa da associação do péptido à membrana, levando a concluir que o cálcio leva a uma diminuição do PI(4,5)P2 sequestrado pelo PBP-10. Neste trabalho iniciou-se ainda o estudo de outra proteína ligante de PI(4,5)P2, o HIV-1 Gag, com um mecanismo de interação membranar bastante mais complexo que o dos domínios PLCδ1 PH ou do péptido PBP-10. Ao contrário destes modelos proteícos, o Gag apresenta uma interação tripartida com a membrana, sugerindo que as interações PI(4,5)P2 – proteína e a organização membranar da proteína serão dependentes também da composição membranar e dos tipos de cadeias acilo do PI(4,5)P2. Neste contexto, iniciámos um processo de otimização da expressão, purificação e marcação com sonda fluorescente da proteína Gag para utilização neste projeto. Em suma, no conjunto dos estudos que constituem esta dissertação, foi observado que:
i. PH-YFP (modelo de ligação ao PI(4,5)P2 de alta afinidade) interage fortemente com os clusters de PI(4,5)P2, a concentrações fisiológicas de cálcio e PI(4,5)P2, e não consegue sequestrar o lípido destes domínios;
ii. As variações dos níveis de cálcio dentro da sua gama de concentrações intracelulares, aparentam não só influenciar a compartimentalização de PH-YFP nos clusters de PI(4,5)P2, como também de influenciar as interações proteína-proteína;
iii. O cálcio induz um efeito de blindagem da carga negativa do grupo hidrófilo do PI(4,5)P2, influenciando a afinidade e a ligação à membrana das suas proteínas ligantes.
iv. Diferentes mecanismos de interação dos modelos proteicos com o PI(4,5)P2 revelam diferenças cruciais relativamente à sua sensibilidade ao cálcio.
Os resultados apresentados demonstram que a regulação indireta das interações proteína-PI(4,5)P2 pelo Ca2+ é mais complexa do que inicialmente considerado. Os dois mecanismos descritos, através dos quais esta regulação poderá ocorrer, deverão atuar concertadamente, criando um nível adicional de regulação das proteínas ligantes de PI(4,5)P2, através do qual as flutuações dos níveis intracelulares de cálcio são associadas a variações da afinidade e da organização destas proteínas pelo PI(4,5)P2. É de prever que estes efeitos deverão ser especialmente importantes na vizinhança de canais de cálcio, onde as flutuações temporárias de concentração de cálcio são muito mais elevadas. É também de frisar que estes efeitos, afetarão diferentes proteínas de diferentes modos, podendo levar a uma complexa regulação de vias de sinalização. Com isto em mente, o nosso objetivo seguinte será caracterizar também o efeito do catião Mg2+, que possuindo muito menor afinidade para PI(4,5)P2 que o Ca2+, é também capaz de induzir a segregação lateral destes fosfolípidos, ainda que a concentrações iónicas bastante superiores.
Modulation of membrane properties of lung cancer cells by azurin enhances the sensitivity to EGFR-targeted therapy and decreased β1 integrin-mediated adhesion
Publication . Bernardes, Nuno; Abreu, Sofia; Carvalho, Filomena Almeida; Fernandes, Fábio; Santos, Nuno C.; Fialho, Arsénio M.
In lung cancer, the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is one of the main targets for clinical management of this disease. The effectiveness of therapies toward this receptor has already been linked to the expression of integrin receptor subunit β1 in NSCLC A549 cells. In this work we demonstrate that azurin, an anticancer therapeutic protein originated from bacterial cells, controls the levels of integrin β1 and its appropriate membrane localization, impairing the intracellular signaling cascades downstream these receptors and the invasiveness of cells. We show evidences that azurin when combined with gefitinib and erlotinib, tyrosine kinase inhibitors which targets specifically the EGFR, enhances the sensitivity of these lung cancer cells to these molecules. The broad effect of azurin at the cell surface level was examined by Atomic Force Microscopy. The Young 's module (E) shows that the stiffness of A549 lung cancer cells decreased with exposure to azurin and also gefitinib, suggesting that the alterations in the membrane properties may be the basis of the broad anticancer activity of this protein. Overall, these results show that azurin may be relevant as an adjuvant to improve the effects of other anticancer agents already in clinical use, to which patients often develop resistance hampering its full therapeutic response.
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3599-PPCDT
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RECI/CTM-POL/0342/2012