A carregar...
Projeto de investigação
Sem título
Financiador
Autores
Publicações
Highly specific blood-brain barrier transmigrating single-domain antibodies selected by an In Vivo phage display screening
Publication . Aguiar, Sandra Isabel; Dias, Joana N. R.; S. André, Ana; Silva, Lisete M.; Martins, Diana; Carrapiço, Belmira; Castanho, Miguel; Carriço, João; Cavaco, Marco; Aires da Silva, Frederico; [et al.]
A major bottleneck in the successful development of central nervous system (CNS) drugs
is the discovery and design of molecules that can cross the blood-brain barrier (BBB). Nano-delivery
strategies are a promising approach that take advantage of natural portals of entry into the brain
such as monoclonal antibodies (mAbs) targeting endogenous BBB receptors. However, the main
selected mAbs rely on targeting broadly expressed receptors, such as the transferrin and insulin
receptors, and in selection processes that do not fully mimic the native receptor conformation, leading
to mistargeting and a low fraction of the administered dose effectively reaching the brain. Thus, there
is an urgent need to identify new BBB receptors and explore novel antibody selection approaches that
can allow a more selective delivery into the brain. Considering that in vitro models fail to completely
mimic brain structure complexity, we explored an in vivo cell immunization approach to construct a
rabbit derived single-domain antibody (sdAb) library towards BBB endothelial cell receptors. The
sdAb antibody library was used in an in vivo phage display screening as a functional selection of
novel BBB targeting antibodies. Following three rounds of selections, next generation sequencing
analysis, in vitro brain endothelial barrier (BEB) model screenings and in vivo biodistribution studies,
five potential sdAbs were identified, three of which reaching >0.6% ID/g in the brain. To validate the
brain drug delivery proof-of-concept, the most promising sdAb, namely RG3, was conjugated at the
surface of liposomes encapsulated with a model drug, the pan-histone deacetylase inhibitor panobinostat (PAN). The translocation efficiency and activity of the conjugate liposome was determined in
a dual functional in vitro BEB-glioblastoma model. The RG3 conjugated PAN liposomes enabled an
efficient BEB translocation and presented a potent antitumoral activity against LN229 glioblastoma cells without influencing BEB integrity. In conclusion, our in vivo screening approach allowed the selection of highly specific nano-antibody scaffolds with promising properties for brain targeting and drug delivery.
Contribuição para o desenvolvimento de um imunolipossoma com duplo direcionamento ativo para o tratamento de tumores cerebrais
Publication . Rita, Cristina Correia Costa; Silva, Frederico Nuno Castanheira Aires da; Neves, Solange Judite Roque Coelho Alves Gil
Na área da oncologia salientam-se semelhanças fisiopatológicas entre humanos e animais. A terapêutica nos tumores cerebrais representa um grande desafio, visto que, estes são caracterizados por um crescimento rápido e invasivo e os fármacos anti-neoplásicos apresentam grande dificuldade em atravessar a barreira hematoencefálica (BBB). Assim sendo, é imperativo o desenvolvimento de novos sistemas de fármacos que ultrapassem estas limitações. Após a descoberta da estrutura das células neoplásicas e da BBB, as nanopartículas como lipossomas e as moléculas de direcionamento têm demonstrado um grande potencial na modulação da disponibilidade dos fármacos utilizando mecanismos fisiológicos. Deste modo, o presente estudo teve como objetivo contribuir para o desenvolvimento de um imunolipossoma com duplo direcionamento ativo para o tratamento de tumores cerebrais. Para tal, foi testada a expressão do folato e os efeitos citotóxicos do panobinostat (iHDAC) em linhas de tumores cerebrais primárias (U87) e secundárias (MCF7), tendo sido comparado com a atividade de lipossomas encapsulados com panobinostat e/ou acoplados a folatos. Adicionalmente, foram desenvolvidos e testados, num modelo da BBB in vitro, imunolipossomas em fusão com anticorpos de domínio único (FC5 e G3) com a capacidade de atravessar a BBB. Por fim, foi proposto o modelo in vitro da BBB + U87, testando os imunolipossomas com duplo direcionamento para a BBB e para as células neoplásicas.
Foram realizados dois ensaios independentes para cada fármaco e linha celular e em duplicado para cada concentração. A viabilidade celular foi avaliada através do reagente WST-1 e os valores de IC50 calculados através do programa GraphPad Prism 8. Para análise estatística realizou-se uma ANOVA e o teste de Tukey, utilizando o programa R.
Os resultados obtidos sugerem que o panobinostat apresenta um efeito citotóxico nas linhas celulares U87 e MCF7. As formulações lipossomais com vectorização ativa apresentam efeito citotóxico semelhante à formulação livre. Além disso, o panobinostat não apresenta efeitos citotóxicos na linha celular da BBB. Com base nos resultados obtidos no ensaio da BBB in vitro, supõe-se que o anticorpo G3 (29,29%) seja mais eficaz na passagem através da BBB comparativamente ao FC5 (11,62%). No ensaio do modelo BBB + U87 ocorreu diminuição da integridade da barreira, porém observou-se efeito citotóxico na linha U87. Serão necessárias otimizações do novo modelo, estudos pré-clínicos e translacionais para determinar a utilidade clínica e a segurança do panobinostat lipossomal.
Development of a new immunoliposome drug delivery system for treatment of pneumococcal meningitis
Publication . Silva, Marta Lisete Santos da; Silva, Frederico Aires da; Leão, Raquel Sá
A meningite pode ser definida como um processo inflamatório que envolve as meninges, quer as do sistema nervoso central quer as da medula espinal. Dos vários tipos de meningite descritos, a bacteriana é considerada o tipo mais severo. Streptococcus pneumoniae é considerado um dos principais agentes patogénicos responsáveis por este tipo de meningite causando uma alta taxa de mortalidade e morbilidade, e sequelas neurológicas nos sobreviventes. S. pneumoniae é um patógeno humano que coloniza essencialmente a nasofaringe em crianças, sendo uma causa importante de infeções na infância. S. pneumoniae é uma bactéria Gram-positiva, que frequentemente expressa uma cápsula polissacarídea, que constitui um dos seus principais fatores de virulência. Até ao momento, um total de 98 tipos de polissacarídeos capsulares foram descritos diferindo serológica e estruturalmente entre si. Após a colonização, a translocação através da barreira hematoencefálica (BHE) é uma das etapas cruciais para a patogénese da meningite. Têm sido desenvolvidas várias abordagens farmacêuticas com o intuito de combater a infeção causada por S. pneumoniae. No entanto, um grande obstáculo ao tratamento da meningite pneumocócica é a necessidade de desenvolver terapêuticas capazes de atravessar a BHE. A estrutura da barreira hematoencefálica leva a concluir que para criar um tratamento eficiente para a meningite pneumocócica, é necessária uma abordagem constituída por duas partes essenciais: o desenvolvimento do medicamento com as propriedades antibacterianas e a tecnologia de direcionamento para permitir que a molécula atravesse a BHE e seja capaz de combater a infeção. O foco atual é encapsular antibióticos em formulações lipossomais aumentando a atividade antibacteriana e as propriedades farmacocinéticas o que vai trazer várias vantagens ao sistema de administração de medicamentos como, por exemplo: diminuição da toxicidade, alta atividade antimicrobiana contra patógenios, seletividade do alvo e uma melhor biodistribuição. Desta forma, o principal objetivo deste projeto é desenvolver um sistema de administração de fármacos capaz de atravessar a BHE e libertar antibióticos para combater a meningite pneumocócica. Para atingir esse objetivo, propomos uma nova abordagem que engloba as propriedades da administração de fármacos e o direcionamento específico de um imunolipossoma. Para que o imunolipossoma seja direcionado com sucesso para a BHE, dois anticorpos de pequeno domínio, nomeadamente FC5 [55] e G3 (um sdAb recentemente selecionado pelo nosso grupo que é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica), foram acoplados na superfície do lipossoma, permitindo o transporte do lipossoma através da BHE. O uso de anticorpos de pequeno domínio tem várias vantagens relativamente ao uso de IgG, devido ao seu tamanho reduzido, o que facilita o acesso ao alvo. Adicionalmente, estas moléculas são mais estáveis quando em circulação permitindo uma administração mais eficiente. Em suma, ao conjugar a capacidade de um anticorpo de pequeno domínio específico para o direcionamento e translocação da BHE e o encapsulamento de antibióticos no lipossoma é possível criar um sistema capaz de superar os dois obstáculos no desenvolvimento de um tratamento para a meningite pneumocócica: a necessidade de uma terapêutica capaz de atravessar a BHE e as propriedades antimicrobianas necessárias para combater S. pneumoniae. Dessa forma, a libertação gradual dos antibióticos no foco da infeção, resulta num sistema eficiente de administração de medicamentos para o tratamento da meningite pneumocócica. Para o desenvolvimento do projeto foram encapsulados em lipossomas três dos antibióticos mais recorrentemente utilizados no tratamento desta infeção (penicilina, vancomicina e ceftriaxona) com o objetivo de explorar o seu potencial no tratamento da meningite pneumocócica. Para isso, a concentração inibitória mínima dos três antibióticos encapsulados foi determinada em vários serótipos de S. pneumoniae. Uma vez validada a eficiência dos lipossomas encapsulados, foi possível prosseguir para o desenvolvimento de um imunolipossoma. O primeiro passo para o seu desenvolvimento consistiu na expressão dos anticorpos de pequeno domínio em bactérias, e, seguidamente, a sua purificação. Uma vez obtidos os anticorpos , estes foram ligados à superfície do lipossoma. Para esta ligação foram otimizados dois métodos diferentes amplamente utilizados para o efeito: o método da biotina e o método da maleimide. Uma vez otimizados os métodos de ligação, os imunolipossomas obtidos pelos dois métodos foram sujeitos a estudos de translocação para avaliar a sua capacidade de atravessar a BHE. Os estudos de translocação foram realizados utilizando um modelo da BHE in vitro. Através destes estudos verificou-se que o método de ligação usando a biotina é um método de ligação mais eficaz permitindo uma maior translocação do imunolipossoma. Da mesma forma, foi possível concluir que o anticorpo G3 tem uma maior capacidade para atravessar a BHE quando comparado com o FC5. Esta abordagem permitiu o desenvolvimento de um imunolipossoma capaz de atravessar a BHE encapsulando antibióticos capazes de combater S. pneumoniae. Resumidamente, a estratégia estudada no presente projeto resultou num imunolipossoma que poderá corresponder a uma abordagem mais segura e eficiente no tratamento da meningite pneumocócica e ser um candidato promissor no tratamento de outras doenças do sistema nervoso central.
Unidades organizacionais
Descrição
Palavras-chave
Contribuidores
Financiadores
Entidade financiadora
Fundação para a Ciência e a Tecnologia
Programa de financiamento
3599-PPCDT
Número da atribuição
PTDC/BBB-BIO/0508/2014