Studying and targeting the non-coding functions of p53 mRNA in carcinogenesis

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Studying and targeting the functions of p53 mRNA in carcinogenesis

Publication . Gomes, Beatriz Damasceno Esteves de Carvalho; Candeias, Marco Marques; Dias, Deodália Maria Antunes,1952-

A maioria da tradução do ácido ribonucleico mensageiro (mRNA, do inglês ribonucleic acid) é assegurada pela tradução canónica dependente da cap (guanina metilada adicionada à extremidade 5' do pré-mRNA), processo que constitui o maior gasto de energia e recursos na célula. Assim, em resposta a várias condições adversas, como hipóxia, infecção viral, privação de nutrientes e fatores de crescimento, stresse do retículo endoplasmático, entre outras, o mecanismo de tradução dependente da cap é suprimido. No entanto, nestas situações adversas, é de extrema importância a expressão de certas proteínas que regulam a adaptação e a reparação de danos na célula. Sob estas condições limitantes, alguns mRNAs garantem a tradução destas proteínas essenciais através de mecanismos alternativos de iniciação da tradução não canónica. O supressor tumoral p53, codificado pelo gene TP53, é uma proteína reguladora fulcral em condições celulares muito desfavoráveis. Através de processos de tradução canónica, iniciação interna da tradução e de splicing alternativo (excisão de diferentes exões do transcrito), o gene TP53 promove a expressão de pelo menos quinze isoformas da proteína p53. As isoformas da p53 têm alvos únicos de transcrição, geralmente vinculados a funções não redundantes, e demonstram capacidade de resposta a diferentes sinais de stresse. As diferentes características das isoformas da p53 permitem a sua participação em várias vias de regulação celular, nomeadamente a reparação do ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid), regulação do ciclo celular, apoptose, metabolismo e envelhecimento. A expressão da p53 é regulada por vários mecanismos de degradação que incluem a poliubiquitinação mediada por Hdm2 (do inglês murine double minute 2 human homolog) e consequente degradação proteossomal. Apesar da rigorosa regulação da p53 é frequente a associação desta proteína com fenómenos carcinogénicos que levam à formação de tumores particularmente agressivos e resistentes a tratamentos. O gene TP53 constitui um alvo estratégico para as células transformadas, uma vez que a expressão aberrante das isoformas da p53 lhes permite superar as adversidades impostas pelo microambiente desfavorável característico no desenvolvimento tumoral. A investigação da nossa equipa está grandemente direcionada para o estudo da isoforma Δ160p53, especificamente o estudo do IRES (do inglês, internal ribosome entry site) da Δ160p53 recentemente identificado, uma vez que as células que sobre-expressam esta isoforma registam elevada proliferação celular e capacidade de invasão particularmente agressiva, em comparação com as características induzidas por outras isoformas. De acordo com a linha de investigação da nossa equipa, a abordagem que propomos para o estudo do mecanismo de iniciação da tradução mediado por IRES Δ160p53 prende-se na identificação de pequenos compostos farmacológicos que inibem o IRES Δ160p53. Com esse objectivo, começámos por estabelecer as condições ideais, a linha celular e o sistema mais indicado para a triagem desses compostos. Simultaneamente, clonámos plasmídeos resistentes à neomicina contendo um sistema bicistrónico com dois genes repórteres RLuc e FLuc (do inglês, Renilla Luciferase e Firefly Luciferase, respetivamente), usando sequências contendo Δ160p53 IRES já disponíveis no laboratório, a fim de obter células eucarióticas estáveis para os ensaios de seleção de compostos farmacológicos. No período em que decorreram estes procedimentos não foi possível testar os plasmídeos clonados e avaliar o seu desempenho em ensaios de seleção dos compostos farmacológicos, no entanto apresentamos a melhor estratégia de clonagem entre as duas abordagens aplicadas. Paralelamente, o nosso laboratório investe na identificação de outros mRNAs de proteínas que frequentemente se encontram alteradas no cancro, para além do mRNA da p53, e que são traduzidos através de IRES e especificamente regulados pelo Hdm2, uma vez que este pode atuar como ITAF (do inglês, IRES transacting factor), regulando positivamente estas proteínas. Deste modo, modificámos a sequência de Hdm2 disponível no laboratório através de mutagénese direcionada ao codão 395. O codão 395 possui uma Serina que é fosforilada após danos infligidos no DNA, o que por sua vez, desencadeia a atividade do Hdm2 como ITAF. Assim, alterámos a serina para uma alanina, que não pode ser fosforilada e portanto, não será capaz de se ligar aos mRNAs. A segunda mutagénese modificou a Serina para Ácido Aspártico, dado que este mimetiza a Serina fosforilada, induzindo permanentemente a atividade do Hdm2 como ITAF. Estas sequências foram enviadas para o laboratório do Departamento de Genética Humana do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge (INSA), em Lisboa, Portugal, para realizar co-imunoprecipitação (co-IP) dos mRNAs ligados a Hdm2. Inicialmente, os investigadores focaram-se na regulação da p53 ao nível proteico, no entanto com o surgimento de evidências relativas às funções reguladoras dos mRNAs, para além do seu conhecido papel na tradução, uma nova atenção direcionou-se para o mRNA da p53. De facto, foi demonstrado que o mRNA da p53 tem uma função protetora sobre a proteína p53, bloqueando a sua degradação sob stresse celular. Adicionalmente, descobertas recentes correlacionaram a modificação pós-transcripcional m6A (modificação do mRNA de mamíferos em bases de adenina por adição de um grupo metilo na posição 6 do nitrogénio) com o início de tradução independente da cap. Dado o recente surgimento de indícios que apontam para existência de modificações m6A localizadas nas proximidades de IRES, e a sua potencial relação com o início da tradução mediada por IRES, propusemos a determinação desta modificação na adenina do codão 213, um codão comummente mutado na isoforma Δ160p53. Para este fim, optimizámos a ligação de sondas de DNA híbrido (sondas de DNA modificadas com ribonucleótidos) ao RNA total extraído de HeLa (linha celular derivada de cancro de colo do útero humano) e A549 (linha celular derivada de carcinoma de pulmão humano). Foram desenhados dois conjuntos de sondas para cada uma de três sequências: para a sequência de interesse Δ160p53 contendo o codão 213, para o controlo positivo MALAT1 e para o controlo negativo composto pela sequência Δ160p53 contendo o codão de iniciação AUG160. Os produtos obtidos foram amplificados por PCR e separados por separação em gel de agarose, em que a observação de bandas indica a ausência de metilação da adenina nas sequências analisadas. Apesar de não ter sido possível determinar se a adenina do codão 213 se encontra metilada, demonstrámos que as sondas projectadas se ligam devidamente às sequencias seleccionadas e que ocorreu ligação entre as sondas por via da T3 ligase utilizada. Com o cumprimento dos objetivos definidos para a presente dissertação, procuramos discernir quais são as melhores abordagens para a triagem dos compostos farmacológicos direcionados à inibição do IRES Δ160p53, para além de produzir ferramentas essenciais para os ensaios de Hdm2-coIP e para a triagem dos fármacos. Por outro lado, com a adoção de um novo método para a determinação da modificação m6A em mRNA da isoforma Δ160p53, ambicionamos estabelecer as bases para os estudos da função desta modificação na tradução não-canónica do mRNA. Por fim, com a presente dissertação, esperamos contribuir para a valiosa investigação sobre os mecanismos de tradução mediada pelo IRES e fornecer novos dados que auxiliem o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

2019Dissertação de mestrado

Acesso aberto

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Entidade financiadora

Fundação para a Ciência e a Tecnologia

Programa de financiamento

3599-PPCDT

Número da atribuição

PTDC/MED-ONC/32048/2017