Browsing by Author "Batista, Joana Domingues Leal"
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- Produção de proteínas recombinantes inspiradas no adesivo do ouriço do mar e sua adesão a diferentes substratosPublication . Batista, Joana Domingues Leal; Santos, Romana Lopes Almeida; Viana, Ana Maria V. S.Os ouriços do mar Paracentrotus lividus possuem órgãos adesivos especializados, os pés ambulacrários, que produzem secreções adesivas e “desadesivas”, para se fixarem fortemente ao substrato, mas de forma reversível. Este bioadesivo, ao contrário dos adesivos sintéticos, é resistente e eficaz na presença de água e adere a várias superfícies naturais e sintéticas. Possui forças de adesão inferiores aos adesivos sintéticos, mas superiores aos adesivos biológicos como a fibrina, utilizada atualmente como adesivo cirúrgico. Por estas razões, poderá vir a ter futuras aplicações biomédicas, no entanto, a quantidade de adesivo secretado é reduzida, pelo que a extração e purificação de proteínas adesivas diretamente dos tecidos ou da secreção é incompatível com uma aplicação prática. Por este motivo, neste estudo, optou-se pela produção de uma proteína recombinante, inspirada na proteína adesiva Nectina, cuja sequência completa é conhecida e que se sabe estar altamente sobre-expressa no disco adesivo dos pés ambulacrários do ouriço do mar P. lividus, sendo também secretada para o adesivo, indicando que está provavelmente envolvida na adesão deste animal ao substrato. Neste trabalho recorremos à produção heteróloga de Nectina (rNec) em Eschrichia coli, otimizando a sua expressão recorrendo a um gene sintético e testando vários meios e condições de crescimento, seguido da otimização da lise celular e purificação da proteína por Cromatografia de Afinidade por Iões Metálicos Imobilizados (IMAC) e caracterização por SDS-PAGE e Western Blotting. As propriedades adesivas da rNec foram testadas em diversas superfícies e avaliadas através de várias técnicas complementares tais como Testes rápidos de revestimento de superfície, Goniometria, Elipsometria, Ressonância de Plasmão de Superfície (SPR) e Microscopia de Força Atómica (AFM). Os resultados obtidos mostram que entre as condições testadas, a melhor forma de produzir a rNec com o vector pHTP1 e em E. coli BL21, é efetuar o crescimento em meio de auto-indução e uma temperatura de incubação de 25ºC, uma vez que obtivemos uma fração solúvel com maior quantidade de proteína e consequentemente uma maior quantidade da proteína de interesse. No entanto, não se obteve a rNec com a massa molecular esperada de 110kDa, mas sim várias versões truncadas com massas moleculares entre os 25 e 75 kDa. Relativamente à purificação da rNec, a utilização de 50 mM Tris e 500 mM NaCl (pH 7.4) nos tampões de ligação e eluição e de um gradiente de eluição linear até atingir 300 mM de imidazole, permitiu obter uma fração enriquecida em rNec (rendimento final de cerca de 1.2 mg/L), embora com alguma co-eluição de proteínas de E. coli. Esta fração de purificação foi de seguida avaliada relativamente às suas propriedades adesivas utilizando várias técnicas, concluindo-se que possuí propriedades de adsorção similares ao Fibrinogénio (precursor da fibrina) em superfícies hidrofóbicas e hidrofílicas, mas com um desempenho superior em superfície carregadas negativamente. O filme proteico obtido com fração de purificação com rNec, tem uma topografia semelhante à observada anteriormente para o adesivo secretado pelo ouriço do mar P. lividus, sendo constituída por nanoestruturas globulares, e quando testado em solução produz forças adesivas superiores às anteriormente registadas para o adesivo secretado por P. lividus e curvas de força distância com uma aparência de serrilha (característico dos bioadesivos marinhos) e que é indicativo de abundância de folhas ß na sua estrutura. A multiplicidade e complementaridade das técnicas utilizadas permitiu obter com sucesso a primeira proteína adesiva recombinante inspirada em ouriços do mar, em quantidades suficientes, para avaliar as suas propriedades adesivas, dando assim mais um passo para o desenvolvimento de adesivos biomiméticos para futuras aplicações biomédicas ou industriais.