Monteiro, Francisca Sarreira Simões HortaDionísio, FranciscoLuz, Bruno Tiago da Silva2025-02-0420252024http://hdl.handle.net/10400.5/98083Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasQuando populações de bactérias geneticamente sensíveis a um antibiótico bactericida são expostas a esse composto, as células não morrem de forma instantânea. Inicialmente, observa-se uma fase de morte exponencial, na qual a maioria das células é eliminada, levando a uma redução significativa do tamanho populacional. No entanto, segue-se uma segunda fase distinta, durante a qual uma subpopulação residual de células sobrevive por períodos consideravelmente mais longos. Nesta fase, o declínio do número populacional ocorre de forma muito mais lenta, dando a impressão de que estas células são geneticamente resistentes ao antibiótico, embora, na realidade, não o sejam. Esta segunda fase deve-se a um fenómeno denominado de persistência, caracterizado por um estado de dormência em que células com baixa atividade metabólica e taxa de crescimento conseguem sobreviver à exposição a agentes citotóxicos, como os antibióticos. Contudo, estas células diferem das células resistentes, pois ao dividirem-se, acabam por morrer. A sua capacidade de sobrevivência ao agente citotóxico está limitada ao período em que permanecem neste estado de dormência. O fenómeno da persistência foi descoberto há mais de 80 anos. No entanto, as suas causas moleculares, fisiológicas e evolutivas permanecem ainda por esclarecer. A maioria dos investigadores que estuda este fenómeno considera que a persistência tem uma base genética que terá evoluído especificamente para a sobrevivência em certas condições de stress, como por exemplo exposição a compostos citotóxicos. Contudo, outros investigadores têm usado argumentos evolutivos, matemáticos e experimentais para defender a hipótese que a persistência não tem uma base genética específica. De acordo com esta segunda hipótese a persistência resulta de erros aleatórios que ocorrem durante a divisão celular, e é apenas a consequência direta da incapacidade temporária de algumas células retomarem as divisões celulares, sendo estas células temporariamente incapazes de se replicar, e também temporariamente refratárias aos antibióticos. Esta hipótese foi recentemente corroborada com resultados experimentais realizados com uma estirpe bacteriana contendo um plasmídeo, não sendo claro qual o papel deste elemento extra-cromossómico. Outra hipótese, mais recentemente formulada, que tenta explicar a persistência, congrega ambas as perspetivas das duas hipóteses que a antecederam. Segundo esta nova hipótese a persistência é o resultado da disrupção aleatória de grandes redes biomoleculares, em vez da ativação de vias génicas específicas. Apesar disto, aquando do estudo de células persistentes, os investigadores tendem a encontrar perturbações em certas vias génicas que surgem mais frequentemente alteradas. Nomeadamente, em genes correlacionados com: módulos toxina-antitoxina; resposta ao stress; reparação de danos no DNA; regulação do metabolismo; comunicação celular; sistemas de bombas de efluxo e modificações epigenéticas. Devido à capacidade de retomar o crescimento após o cessar dos tratamentos e do ambiente estar livre de antibióticos, nos últimos anos as células persistentes têm vindo a ser reconhecidas pela comunidade científica como uma das maiores causas do insucesso destas terapias e da recorrência de doenças infeciosas bacterianas. Contudo, a resistência a antibióticos continua a ser o maior obstáculo ao combate e eliminação destas infeções, dado que a mesma se encontra imensamente dispersada pelas comunidades microbianas, sendo facilmente adquirida e desenvolvida pelas bactérias. Dado este contexto, este estudo foi desenvolvido com o principal objetivo de estudar o impacto de mutações cromossómicas e de plasmídeos, conferentes de resistência a diferentes antibióticos, no decaimento de uma população bacteriana e na sua subpopulação de células persistentes, quando submetidas a um antibiótico (ampicilina) para o qual não possuem resistência. Para isto, utilizámos estirpes de Escherichia coli K12, com mutações pontuais no seu cromossoma bacteriano que conferem resistência a antibióticos com mecanismos de ação diferentes dos da ampicilina, nomeadamente o ácido nalidíxico e/ou a rifampicina, e/ou com plasmídeos isolados naturais (RN3 e R702) que conferem resistência a outros antibióticos que não a ampicilina. Como controlo, utilizámos uma estirpe derivada de E. coli K12 que não é resistente a antibióticos nem contém qualquer plasmídeo. Ao analisar curvas de morte de bactérias, de acordo com argumentos matemáticos, é esperado que as populações bacterianas decaiam numa primeira fase de forma rápida e exponencial. Contudo, numa segunda fase, quando apenas se mantêm vivas as subpopulações de células persistentes, é esperado que estas decaiam mais lentamente e de acordo com uma distribuição exponencial ou de lei de potência se a persistência tiver ou não uma base genética, respetivamente. Dado isto para além do objetivo principal acima descrito, esta tese teve ainda como objetivo secundário o estudo matemático das cinéticas de morte das populações bacterianas na primeira e segunda fase do seu decaimento. E desta forma avaliar quais das duas distribuições matemáticas (exponencial ou lei de potência) melhor descreve o decaimento das subpopulações de células persistentes. Para analisar as cinéticas de morte das diferentes bactérias acima listadas foram realizados vários ensaios de curva de morte. Estes ensaios consistiram na adição de um antibiótico (ampicilina) para o qual as células bacterianas não apresentavam resistência, e tiveram uma duração de 6 dias, durante os quais, diferentes amostras das culturas foram retiradas em períodos de 24 h, de forma a estimar o número de células bacterianas ao longo do tempo. Após a contagem de colónias e estimação do número de células bacterianas ao longo do tempo em cada momento analisado, as cinéticas de morte das diferentes estirpes analisadas foram calculadas, e o seu decaimento foi estudado matematicamente e ilustrado em diferentes gráficos. Os nossos resultados indicam que na primeira fase das curvas de morte, as bactérias E. coli K12 com mutações cromossómicas conferentes de resistência a apenas um antibiótico (ácido nalidíxico ou rifampicina) decaem mais rápido do que o controlo (que não possui resistência a algum antibiótico), enquanto que as bactérias com mutações cromossómicas conferentes de resistência a ambos os antibióticos apresentam uma taxa de sobrevivência maior nas primeiras horas de decaimento. Contudo, as subpopulações de células persistentes destas bactérias apresentaram taxas de decaimento semelhantes às do controlo, não revelando nenhum impacto destas mutações na segunda fase das curvas de morte destas estirpes. Para além disto, neste estudo também observámos que a subpopulação de células persistentes de E. coli portadoras do plasmídeo R702 ou do plasmídeo RN3 apresentaram uma taxa de decaimento maior ou reduzida em comparação com o controlo, respetivamente. Contudo, nenhum destes plasmídeos teve um impacto significativo na primeira fase de morte destas bactérias, tendo esta sido idêntica à da estirpe controlo. Com o objetivo de avaliar se a taxa de crescimento das bactérias estudadas se encontrava correlacionada com as suas respetivas taxas de decaimento, medimos as curvas de crescimento de todas as estirpes analisadas. Para isto, foi utilizado um leitor de microbiologia (Bioscreen), que nos permitiu acompanhar o crescimento das diferentes bactérias, ao medir a absorbância a OD600 nm de 10 min em 10 min durante um período de 24 h. Uma vez que a maioria dos antibióticos apenas consegue matar células em crescimento, as bactérias com menores taxas de crescimento deveriam apresentar também menores taxas de decaimento. Contudo, após calcular as taxas de crescimento das diferentes estirpes analisadas, observámos que as diferenças nas taxas de crescimento não conseguiam explicar as diferenças observadas no decaimento destas estirpes. Ao analisar as estirpes com menores taxas de crescimento, observámos que algumas destas não seguem esta hipótese, nomeadamente as que possuem mutações cromossómicas que conferem resistência à rifampicina e aquelas que contém o plasmídeo R702 (e possuem ou não resistências cromossómicas), uma vez que numa determinada fase das suas curvas de morte, estas decaem mais rapidamente do que a estirpe controlo. Para além disto, esta hipótese não conseguiu explicar outros resultados (como o decaimento mais rápido na primeira fase da curva de morte da estirpe que possui mutações cromossómicas e carrega o plasmídeo RN3, ou as taxas de decaimento na segunda fase, semelhantes ao controlo, das estirpes com mutações cromossómicas que conferem resistência ao acido nalidíxico e/ou à rifampicina). Portanto, suspeitamos que outras causas (como a epistasia genética) possam explicar esses resultados. Sendo que, após o estudo matemático dos decaimentos das diferentes populações bacterianas, os nossos resultados evidenciavam uma ligeira tendência que favorecia a distribuição exponencial em detrimento da distribuição de lei de potência, indicando possivelmente um mecanismo genético para a persistência. Contudo, estes resultados não são suficientes para definir adequadamente qual distribuição (exponencial ou lei de potência) melhor se adequa ao decaimento das subpopulações de persistentes, sendo necessária a realização de mais experiências com este objetivo.Bacterial persistence is a state of dormancy in which a subpopulation of bacterial cells with low metabolic activity and growth rates are capable to survive to temporary exposition to antibiotics. In contrast, antibiotic resistance is the ability of a bacterial population not only to survive but also to replicate in the presence of an antibiotic. While antibiotic resistance is widely recognised as the main cause of antibiotic treatments failure, persistence has emerged in recent years as a significant contributor to the recurrence of bacterial infections, posing a severe threat to human health. To investigate whether resistance to different antibiotics, conferred whether by chromosomal point mutations or plasmids can affect the decay of bacterial populations (including their subpopulation of persisters), we measured the decay of such bacteria under exposition to ampicillin. Additionally, as the decay of persister cells populations can follow an exponential or power-law distribution, we mathematically analysed the decay patterns of these populations. Our results revealed that, Escherichia coli K12 spontaneous mutants resistant to only one antibiotic (nalidixic acid or rifampicin) initially decay faster than expected. In contrast, the double resistant mutant exhibited greatersurvival during the early stages of decay compared to the control strain (lacking resistance determinants). Furthermore, we observed distinct decay rates among persister subpopulations: E. coli carrying the R702 plasmid shown an increased decay rate, while those with the RN3 plasmid demonstrated a reduced decay rate. These variations in the bacterial population decay could not be attributed solely to the differences in growth rates of the respective bacterial strains, suggesting that other factors, such as gene epistasis may play a role. Finally, our results were inconclusive in determining whether an exponential or power-law distribution better fits the decay patterns of persister populations.engPersistênciaResistênciaAntibióticosPlasmídeosBactériasTeses de mestrado - 2025master thesis