Miranda, Marta Pires deGraça, Luís Ricardo SilvaAndersen, Francisca Bixirão Ferreira2023-09-132022-12-14http://hdl.handle.net/10451/59261Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022Os herpesvírus (HVs) são vírus muito prevalentes que estabelecem infeções crónicas (que duram toda a vida) e para os quais não existe cura. O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um vírus oncogénico responsável por provocar doença sintomática maioritariamente em indivíduos imunodeprimidos, tais como pacientes infetados com VIH. O genoma do KSHV é constituído por uma cadeia dupla de DNA que inclui uma região única central, com um tamanho aproximado de 140 kpb, que contém as regiões codificantes e que é flanqueada por repetições terminais (TRs). Como todos os herpesvírus, o KSHV tem um ciclo de vida bifásico, constituído por uma fase lítica e uma fase latente. A fase lítica é caracterizada pela expressão de grande parte dos genes virais e pela produção de novos viriões que, consequentemente, levam à lise celular. A fase latente é a via padrão de infeção do KSHV, na qual o genoma viral é mantido, essencialmente, no núcleo das células B do hospedeiro como uma forma circular extra- cromossómica denominada epissoma. Durante a latência, há uma forte repressão da expressão genética e não há produção de partículas virais, o que permite ao vírus escapar à resposta imunológica do hospedeiro. O balanço entre as fases lítica e latente é essencial para a manutenção e sobrevivência do vírus. O antigénio nuclear associado à latência (LANA) é altamente expresso em células infetadas de forma latente. Esta proteína multifuncional, com 1162 aminoácidos, é responsável pela persistência e pela segregação do epissoma viral nas células, o qual é replicado juntamente com o genoma celular. Para exercer a sua função, a LANA liga-se aos TRs do genoma viral através da sua região C-terminal e a histonas do DNA celular através da sua região N-terminal. A LANA também é capaz de regular a expressão dos genes virais afetando as modificações da cromatina viral, através da interação com complexos de modificação de histonas. Uma das mais importantes modificações de histonas virais é a tri-metilação do 4º resíduo de lisina da histona H3 (H3K4me3), presente em TRs do DNA viral e envolvida na ativação de genes da fase latente. Recentemente, foi descrito que a LANA inibe a atividade do complexo de metilação MLL1, responsável pela deposição de H3K4me3 em TRs. A atividade deste complexo depende do WDR5, que se liga normalmente à MLL1 através de um motivo de interação com WDR5 (WIN). A LANA também tem um motivo WIN capaz de se ligar ao WDR5, competindo com a MLL1 e regulando a deposição deH3K4me3. Além disso, descobriu-se que a DNase1L3 celular degrada o DNA do KSHV após a infeção e que os níveis de DNA viral correlacionam-se negativamente com os níveis de H3K4me3 nos TRs. Consequentemente, esse padrão de metilação foi visto recentemente como um novo mecanismo de defesa antiviral do hospedeiro. Uma das limitações para o estudo in vivo do KSHV é a falta de um modelo animal de infeção, uma vez que este vírus só infeta humanos. O herpesvírus de murganho 68 (MHV-68) está geneticamente relacionado com o KSHV e consegue estabelecer uma infeção latente em murganhos, representando por isso um bom sistema modelo a usar. Após a inoculação intranasal do vírus em murganhos, ocorre uma fase de replicação lítica nas células epiteliais pulmonares. De seguida, o vírus dissemina-se para o baço onde infeta as células B do centro germinativo. Aí, ocorre a proliferação de células B infetadas, sucedendo-se o estabelecimento de latência nas células B de memória. Estas constituem o reservatório viral a longo prazo. O MHV-68 também expressa uma proteína LANA (mLANA) funcionalmente homóloga à LANA do KSHV (kLANA). Assim, foi criado um vírus MHV-68 quimera, no qual a mLANA foi substituída pela kLANA, no genoma do MHV-68, permitindo o estudo das funções da kLANA durante a infeção in vivo. O objetivo deste estudo foi analisar a relevância do motivo WIN da kLANA, avaliando a sua capacidade de inibir a atividade da MLL1, através do uso do vírus MHV- 68 quimera em infeções in vivo. Duas mutações no motivo WIN da kLANA foram previamente criadas – uma para aumentar (AARA) e outra para enfraquecer (PAA) a afinidade da kLANA pelo WDR5. Os efeitos destas mutações no estabelecimento de latência in vivo foram estudados. O gene mutado que codifica para a kLANA foi clonado num cromossoma artificial bacteriano (BAC) que contém o genoma do MHV-68, substituindo o gene que codifica a mLANA, através de recombinação homóloga. Os BACs mutantes AARA e PAA foram construídos de modo a expressarem a yellow fluorescent protein (YFP), o que permite rastrear a infeção através de análises por citometria de fluxo. Após a obtenção de vários clones, estes foram selecionados de acordo com a presença correta da kLANA nos BACs recombinantes através de PCR e dos perfis de digestão do genoma de MHV-68 com as enzimas de restrição EcoRI, BamHI, HindIII e ApaI. Depois da produção de stocks virais dos vírus mutantes, a partir dos BACs, foram realizados ensaios in vitro para analisar a cinética de crescimento dos vírus e para confirmar a expressão de proteínas. Para analisar a cinética de crescimento, células permissivas foram infetadas com os vírus mutantes, v-AARA.yfp e v-PAA.yfp, e com os vírus controlo, v-WT.yfp e v-kLANA.yfp. As células infetadas foram recolhidas em seis tempos específicos: 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas pós-infeção. Depois de terem sido congeladas, as amostras foram tituladas. Os títulos virais obtidos permitiram traçar uma curva de crescimento para cada vírus. Verificou-se que os vírus quimera apresentaram um crescimento in vitro semelhante ao do vírus MHV-68 wild-type (WT). Além desta experiência, também foi realizado um Western blot para a deteção das proteínas kLANA, YFP, mLANA, M3 (proteína viral que se liga a quimiocinas) e da proteína celular actina. Confirmou-se que as mutações introduzidas no motivo WIN da kLANA não afetaram a expressão normal da kLANA. Contudo, nem todos os vírus expressaram YFP, pelo que os que estavam nesta condição foram excluídos dos ensaios futuros. De seguida, sucederam-se os ensaios animais para o estudo do estabelecimento de latência in vivo, sendo que 3 grupos de 5 murganhos da estirpe BALB/cByJ foram inicialmente infetados com os vírus quimera (v-kLANA.yfp) e com o vírus MHV.68 WT (v-WT.yfp). Este primeiro conjunto de infeções permitiu verificar a consistência dos resultados obtidos com o que já tinha sido descrito e serviram como controlos standard para as experiências seguintes realizadas com os vírus mutantes. Para analisar a relevância das mutações, 3 grupos de 5 murganhos foram infetados com os vírus mutantes (v- AARA.yfp e v-PAA.yfp) e com o vírus quimera (v-kLANA.yfp), enquanto controlo desta experiência. Ao 14º dia após a inoculação intranasal (pico de latência), os murganhos foram sacrificados e os baços foram removidos e devidamente processados para os ensaios subsequentes. Para avaliar os níveis de latência, foi realizado um ensaio de reativação ex vivo, baseando-se na cultura simultânea de células permissivas e células do baço de murganhos infetados. Além disto, também foi determinada a frequência de células positivas para a presença de DNA viral, através do ensaio de diluição limitante e PCR em tempo real. Concomitantemente, a frequência de células do baço infetadas também foi avaliada por citometria de fluxo. Ao 14º dia pós-infeção, todos os vírus apresentaram níveis semelhantes, quer de latência, quer de células positivas para o DNA viral. No entanto, ao 21º dia pós-infeção verificou-se que o vírus mutante v-PAA.yfp apresentou níveis significativamente mais baixos de latência em comparação com o vírus quimera controlo. A frequência de células positivas para o DNA viral também foi significativamente mais baixa para o v-PAA.yfp em relação ao controlo. Deste modo, os resultados in vivo demonstraram que enfraquecer a interação entre kLANA e WDR5 não afetou a expansão das células B do centro germinativo no baço, que constituem o principal alvo do MHV-68 para o estabelecimento de latência. No entanto, levou à redução dos níveis de latência aos 21 dias pós-infeção, possivelmente afetando a persistência do epissoma a longo prazo e corroborando o mecanismo supramencionado. Aumentar a afinidade da kLANA para o WDR5 não teve um efeito marcante nos níveis gerais de latência. Estudos complementares devem ser realizados para esclarecer estes resultados e a importância da MLL1 e a sua interação com a kLANA e o WDR5, a tri-metilação de histonas virais e a degradação do DNA viral.Herpesviruses (HVs) are ubiquitous viruses that establish lifelong infections and for which there is no cure. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is an oncogenic virus responsible for disease in mostly immunocompromised individuals. KSHV has a biphasic life cycle, consisting of a lytic phase and a latent phase (default pathway of infection). Latency-associated nuclear antigen (LANA) is a multifunctional protein, abundantly expressed in latently infected cells, that can regulate viral gene expression by affecting viral chromatin modifications, through the interaction with histone modification complexes. Tri-methylation of the 4th lysine residue of histone H3 (H3K4me3), found in terminal repeats (TRs) viral DNA, is involved in the activation of latency genes. LANA was found to inhibit the activity of MLL1 methylation complex, responsible for H3K4me3 deposition in TRs. The activity of this complex depends on WDR5, which binds to the WIN motif of MLL1. LANA has a WIN-like motif able to bind to WDR5, competing with MLL1 and regulating H3K4me3 deposition. Furthermore, it was discovered that cellular DNase1L3 degrades KSHV DNA following infection and that virus DNA levels are negatively correlated with TR H3K4me3 levels. The aim of this study was to assess the relevance of the WIN-like motif of LANA, evaluating its capacity to inhibit the activity of MLL1, using an in vivo animal model. MHV-68 chimeric viruses were constructed where MHV-68 LANA (mLANA) was replaced for KSHV LANA (kLANA). Additionally, two sets of mutations in the WIN-like motif of kLANA were engineered, one to increase and the other to impair the affinity of kLANA to WDR5, and the effects in the establishment of latency were studied. In vivo results demonstrated that impairing the interaction between kLANA and WDR5 did not affect the expansion of germinal centre B cells in the spleen, the main target of MHV-68 for the establishment of latency. However, it led to reduced lat he mechanism described above. Increasing kLANA affinity to WDR5 had no marked effect on the overall latency levels. Complementary studies should be performed to clarify these results and the importance of MLL1, regarding its interaction with kLANA and WDR5, tri-methylation of viral histones and viral DNA degradation.engHerpes vírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV)Antigénio nuclear associado à latência (LANA)Herpesvírus de murganho 68 (MHV-68)MLL1LatênciaTeses de mestrado - 2022master thesis203135563