Figueiredo, Luísa MirandaCarvalho, Margarida Henriques da GamaFerreira, David Filipe Valente2024-03-182024-03-1820242023http://hdl.handle.net/10451/63488Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasTrypanosoma brucei, é um parasita unicelular extracelular que é conhecido pelo seu impacto devastador na Africa sub-Saariana, causando a tripanossomíase africana, uma doença caracterizada por sintomas graves e frequentemente fatais, em humanos e animais. Entre as suas características marcantes, destaca-se uma em particular: a perda de peso significativa e muitas vezes rápida experienciada por indivíduos infetados. Este fenómeno tem sido associado a uma interação complexa entre o parasita e o tecido adiposo do hospedeiro, que emerge como o terceiro maior reservatório de parasitas durante a infeção, abrigando algumas das concentrações mais elevadas de parasitas entre todos os órgãos do hospedeiro à medida que a doença progride. Dentro deste microambiente, o parasita passa por uma transformação notável, dando origem às necentemente caracterizadas formas do tecido adiposo (ATFs) especializadas. Estes ATFs exibem alterações marcantes na expressão génica e no metabolismo quando comparados aos seus parentes encontrados no sangue, sugerindo uma adaptação refinada ao ambiente rico em lípidos. Entre as adaptações notáveis encontram-se o aumento na expressão de genes associados à β-oxidação, uma via crucial no metabolismo lipídico, e um crescimento mais lento. Além disso, os ATFs demonstraram também consumir miristato, um ácido gordo com implicações profundas no processamento lipídico, marcado radioativamente, enquanto o mesmo não sucede nos parasitas encontrados no sangue. Todas juntas estas observações apontam para a possível existência de metabolismo lipídico nos ATFs, que serviria não só de base para parcialmente explicar a preferencia dos parasitas pelo tecido adiposo, mas também para justificar a presença de genes envolvidos na β-oxidação no genoma do parasita, que até à data não foram descritos como tendo uso funcional. Neste estudo, mergulhamos nas dinâmicas complexas da interação do T. brucei com adipócitos em ensaios in vitro, lançando luz sobre os mecanismos subjacentes à perda de gordura no tecido adiposo, um aspeto crítico da doença. As nossas descobertas indicam que o parasita é capaz de induzir lipólise em adipócitos diferenciados in vitro por si só sem a necessidade da atuação de fatores externos como células imunes, como havia sido descrito anteriormente. Esta indução não é uma consequência passiva da presença do parasita, mas sim um processo cuidadosamente orquestrado, e detetado apenas depois de 24 horas de exposição. Com uso de ensaios que preveniam o contacto direto entre parasitas e adipócitos conseguimos determinar que esta indução é mediada por um fator secretado pelo parasita, pelo que interação direta não é necessária. Relativamente ao curioso lapso temporal entre a exposição dos adipócitos aos parasitas e o aumento na secreção de ácidos gordos e glicerol, foram também testados e descartados fatores potenciais que contribuíssem para o atraso de mais 24 horas na indução da lipólise. Concluiu-se que este atraso não é atribuível à necessidade de diferenciação do parasita para a sua forma stumpy (caracterizada por possuir o ciclo celular suspenso e estar pré-adaptada para transmissão ao vector), a mecanismos de concentração de limite ou à necessidade de adaptação do parasita aos adipócitos, e a conseguinte diferenciação em ATFs. Tendo muitos destes resultados sido obtidos a partir da produção de meio condicionado derivado do parasita, onde os parasitas haviam existido em cultura em condições semelhantes a ensaios anteriores. Este meio condicionado retém a capacidade lipolítica dos parasitas apesar de não possuir parasitas vivos presentes, servindo não só de base para grande parte das experiencias mas também consolidando a ideia de que a lipólise é induzida por um fator secretado. Estudos prévios haviam já descrito a capacidade do parasita de modular o seu ambiente, em particular células imunes através da secreção de proteínas, e por este motivo testamos se o fator lipolítico presente seria uma proteína solúvel. Contudo a digestão de proteínas do meio condicionado, não foi suficiente para remover a capacidade lipolítica do meio, sugerindo que o fator responsável não era uma proteína solúvel. Testamos ainda o impacto das vesículas extracelulares, uma vez que também elas haviam sido descritas como ferramentas moduladoras utilizadas pelo parasita durante a infeção, mas a exposição dos adipócitos a vesículas extracelulares derivadas do parasita não produziu um aumento significativo da lipólise. Apesar disto, durante a exposição dos adipócitos ao meio condicionado de onde as vesículas haviam sido isoladas, ou seja sem as vesículas presentes, o oposto foi observado. Indicando que o fator lipolítico se trata de uma pequena molécula que permanece suspensa no meio condicionado após o isolamento das vesículas. A alteração do pH e a depleção de nutrientes no meio devido ao crescimento dos parasitas foram também testados ao que nenhum efeito no fenótipo lipolítico se observou, confirmando que o fator lipolítico tem origem nos próprios parasitas. Para averiguar se a molécula alvo se tratava de facto de uma pequena molécula, o meio condicionado foi filtrado com um filtro de 3KDa, onde se observou um aumento na secreção de ácidos gordos e glicerol, na porção filtrada. Concluindo que o fator responsável pelo aumento da lipólise é de facto uma pequena molécula com tamanho inferior a 3KDa, tratando-se provavelmente de um metabolito ou molécula de RNA ou DNA. Este estudo revelou também a influência da exposição ao T. brucei na expressão génica de enzimas lipolíticas nos adipócitos. Os níveis de transcrição da lipase adiposa triglicerídica (ATGL) e da lipase sensível a hormonas (HSL), as duas principais enzimas na via lipolítica neutra, exibiram padrões de expressão semelhantes em adipócitos estimulados, diferindo no entanto dos níveis de expressão observados nos controlos não estimulados. Tendo um aumento inicial dos transcritos sido observado, nas primeiras horas seguido de uma diminuição acentuada nos níveis de mRNA, que gradualmente recuperaram para os níveis dos controlos não estimulados até às 24 horas de exposição. Sugerindo a possibilidade de um ciclo de feedback negativo ou de mecanismos regulatórios desencadeados após o estimulo inicial proveniente do parasita. Se as alterações observadas na transcrição destas enzimas são derivadas de um estimulo direto do parasita na transcrição, pela secreção de fatores de transcrição por exemplo, ou se são uma consequencia da exaustão das enzimas ativadas por uma via lipolítica adjacente, parmanece desconhecido servindo de alvo para futuros estudos. Em suma, o nosso estudo realça a notável capacidade do T. brucei de induzir a lipólise nos adipócitos através de uma molécula pequena e secretada, lançando nova luz sobre a interação hospedeiro-parasita no tecido adiposo. Estas descobertas têm implicações profundas não apenas para compreender a patogénese da tripanossomíase africana, mas também para desvendar as interações hospedeiro-parasita em diversos contextos de tecidos. A nossa investigação destaca a complexidade deste jogo e abre caminho para estratégias terapêuticas inovadoras contra a tripanossomíase e doenças metabólicas relacionadas. A relevância deste estudo estende-se para além do campo da parasitologia. Compreender os mecanismos que regem a lipólise dos adipócitos pode fornecer valiosos insights em distúrbios metabólicos mais amplos caracterizados pela perda excessiva de gordura, como a caquexia e certos tipos de cancro. Além disso, a identificação de um fator lipolítico pequeno e secretado pelos parasitas apresenta uma potencial via para o desenvolvimento de medicamentos que visam o metabolismo lipídico. Em última análise, este projeto não só contribui para a luta contra a tripanossomíase africana, mas também avança o nosso conhecimento das interações hospedeiro-patogénico com implicações de largo alcance para a saúde humana. Esta exploração aprofundada da influência do T. brucei nos adipócitos abre portas para múltiplas vias de investigação com potencial para impactar vários campos da biologia e da medicina.Trypanosoma brucei infection is characterized by a severe loss of mass and increased lipolysis within the adipose tissue, which serves as one of the parasite's major reservoirs throughout infection. To understand the mechanisms underlying this interaction, we established an in vitro model to study the dynamic interplay between T. brucei and adipocytes. Our findings reveal that after 24 hours of exposure of adipocytes directly to T. brucei or T. brucei-conditioned media, a significant level of lipolysis is induced. Intriguingly, the observed lipolytic effect of T. brucei is only detectable 24 hours after exposure and it is not mediated by the soluble protein or extracellular vesicular component of the secretome as commonly assumed in cell-to-cell communication. It was instead mediated by small molecule(s) with molecular weight below 3 kDa. These molecule(s) could be metabolite(s) or nucleic acids and should be the subject of further investigation. Remarkably, the lipolytic effect of the parasite secretome is not dependent on the differentiation of the parasite into stumpy or adipose tissue forms. However, it did exert a discernible impact on adipocyte gene expression, suggesting a complex and nuanced interaction between T. brucei and host adipose tissue. The 24-hour delay observed in the lipolytic response poses an intriguing question that warrants future exploration. Uncovering the mechanism by which T. brucei stimulates adipocyte lipolysis will advance our understanding on adipose tissue wasting observed during trypanosomiasis and it may potentially offer new avenues for therapeutic intervention in this devastating disease and other metabolic disorders.engTrypanosoma bruceiadipócito 3T3-L1LipóliseSecretomaTeses de mestrado - 2024master thesis203882512