Pankonien, InesAmaral, MargaridaTorres, Raquel Gonçalves2024-07-012024-07-0120242024http://hdl.handle.net/10451/65188Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA fibrose quística (FQ) representa a doença monogénica autossómica recessiva mais prevalente entre indivíduos caucasianos. Indivíduos afetados por esta doença apresentam uma esperança média de vida que ultrapassa ligeiramente os 40 anos. Caracterizada como uma doença crónica, a FQ afeta vários órgãos, incluindo o pâncreas, fígado, rins, glândulas sudoríparas, sistema reprodutor e trato gastrointestinal, manifestando-se de forma mais grave nos pulmões. Esta doença é causada por mutações que ocorrem no gene da CFTR (do inglês “Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator”). A disfunção ou ausência da proteína CFTR na membrana plasmática (MP) leva a um desequilíbrio no transporte de iões e água, culminando na produção de muco espesso e desidratado que obstrui as vias aéreas. Adicionalmente, esta disfunção afeta o normal funcionamento dos cílios impedindo a remoção de patógenos através do batimento ciliar. A principal causa de morbilidade e mortalidade na FQ advém da insuficiência respiratória resultante da acumulação de muco e de infeções pulmonares recorrentes. Dada a inexistência de cura, o tratamento da FQ foca-se maioritariamente no alívio dos sintomas, o qual inclui o uso de antibióticos, anti-inflamatórios, enzimas pancreáticas, medicamentos redutores de ácido e terapias para desobstrução das vias aéreas (como a fisioterapia respiratória e atividades físicas). Avanços terapêuticos significativos foram alcançados com o desenvolvimento de fármacos moduladores da CFTR, como Symdeko®, Orkambi® e Trikafta®, os quais visam corrigir os defeitos moleculares subjacentes, seja pelo aumento de tempo que o canal se encontra aberto (potenciadores) ou promovendo o correto enrolamento (do inglês “folding”) da proteína (corretores). Em casos mais avançados de insuficiência respiratória, o transplante pulmonar surge como último recurso para indivíduos com FQ. A proteína CFTR é um canal para iões cloreto (Cl- ) e bicarbonato (HCO3 - ) expresso na MP apical de células epiteliais de diferentes tipos de tecidos, essencial na manutenção da homeostase iónica. Pertencente à superfamília de transportadores ABC (do inglês “ATP binding cassette”), a CFTR é ativada através do monofosfato cíclico de adenosina (cAMP) e regulada por fosforilação. Ao contrário de outros transportadores ABC, a CFTR favorece um gradiente de concentração e é composta por 5 domínios: dois domínios transmembranares (MSD1/2), dois domínios de ligação a nucleótidos (NBD1/2) e um domínio regulador (RD). Primeiramente, a proteína cinase A (PKA) fosforila o RD para pré-ativar a proteína CFTR. De seguida, mediante a ligação de ATP, os NBD1/2 dimerizam, que por alosterismo levam à abertura e fecho do canal, formado pelos TMD1/2 que formam o poro por onde os iões cloreto e bicarbonato são transportados através da MP. Durante a síntese e folding da CFTR no retículo endoplasmático (RE), dá-se co-traducionalmente a glicosilação básica, dando origem à forma imatura da CFTR (banda B). Após a avaliação do folding pelo sistema de controlo de qualidade do RE (ERQC), a forma imatura da CFTR é exportada para o complexo de Golgi, onde vai sofrendo várias glicosilações complexas até atingir a sua forma madura (banda C). A CFTR é então translocada para a MP apical das células epiteliais, onde desempenha a sua função. Até à data foram identificadas mais de 2.100 variantes do gene CFTR, a maioria presumivelmente patogénica, e que são agrupadas em sete classes distintas com base no seu defeito funcional na proteína CFTR: As variantes de classe I levam à produção de proteínas truncadas derivadas de codões STOP prematuros. As de classe II impedem o tráfego para a MP devido ao folding incorreto da proteína. As variantes de classe III e IV afetam a abertura/fecho normal do canal e a condutância deste, respetivamente. Por sua vez, as de classe V resultam numa drástica diminuição da quantidade de proteína funcional, maioritariamente devido a erros no processo de splicing. Variantes de classe VI perturbam a estabilidade da CFTR na MP. Por fim, as variantes na classe VII caracterizam-se pela falta de produção de mRNA. Neste projeto foram estudadas linhas celulares expressando duas variantes CFTR de classes distintas, nomeadamente a p.Phe508del de classe II, e a p.Gly551Asp, de classe III. A variante p.Phe508del apresenta uma deleção de um resíduo de fenilalanina na posição 508 - é a variante mais comum em FQ, ocorrendo em cerca de 80% dos pacientes. Esta alteração genética provoca o folding incorreto da proteína, levando à sua retenção no RE e degradação prematura que, consequentemente, impede o tráfego da p.Phe508del-CFTR para a MP. Por outro lado, a variante p.Gly551Asp afeta a dinâmica de abertura e fecho do canal (‘gating’) na MP apical de células epiteliais. A CFTR não só regula o fluxo de iões Cle HCO3 - , como também regula outros canais e transportadores iónicos, como é o exemplo do canal epitelial de sódio (ENaC) e dos canais de Clativados por iões cálcio (CaCCs). Para além da sua função como canal aniónico e modulador de outros canais, a CFTR também desempenha um papel central em diversos processos celulares, incluindo a diferenciação e polarização epitelial, desenvolvimento, proliferação e a transição epitelial-mesenquimal (do inglês “Epithelial-Mesenchymal Transition”, EMT). A EMT é um processo complexo do desenvolvimento celular que envolve reprogramação transcricional, no qual as células epiteliais perdem a sua polaridade apical-basal, as junções célula-célula, o formato estrutural da célula e a organização do citoesqueleto. Simultaneamente adquirem características mesenquimais, tais como polaridade anteriorposterior (do inglês “front-rear polarity”) e individualização celular. Essencialmente, as células epiteliais totalmente diferenciadas são reprogramadas em células primordiais, capazes de se diferenciar em vários tipos de células. Este processo também influencia outros processos celulares, como o cancro e o desenvolvimento fetal. O processo de EMT é mediado por fatores de transcrição associados à EMT (do inglês “Epithelial-mesenchymal transition associated transcription factors”, EMTa-TFs) que regulam negativamente genes que codificam marcadores epiteliais e, concomitantemente, ativam a expressão de genes que codificam marcadores mesenquimais. Os EMTa-TFs identificados mais relevantes para a FQ foram: YAP1 (do inglês “Yes-associated protein 1”), TEAD4 (do inglês “TEA Domain Transcription Factor 4”), e TWIST1 (do inglês “Twist related protein 1”). As proteínas YAP1 e TEAD4 pertencem à via de sinalização Hippo. Como este fator de transcrição não possui um domínio de ligação ao DNA, o YAP1 transloca-se para o núcleo e associa-se a outros parceiros, como o TEAD4, para regular a transcrição de genes relacionados com a EMT. Por outro lado, quando a via de sinalização Hippo é ativada uma cascata de cinases que ativa por último a cinase 1/2 (LATS1/2, do inglês, "Large tumor suppressor kinase 1/2") através da fosforilação. Consequentemente, a LATS1/2 irá fosforilar o YAP1. A fosforilação do YAP1 leva à ligação da proteína 14-3-3, inibindo a translocação do YAP1 para o núcleo. Dessa forma, o YAP1 é incapaz de se associar ao TEAD4 e, portanto, a transcrição génica não se inicia. Adicionalmente, o TWIST1 está envolvido em várias vias de sinalização, sendo uma delas a via Hippo. O TWIST1 ativa a expressão do PAR1 (do inglês, "Protease-activated receptor 1"), que codifica recetores acoplados à proteína G. Foi demonstrado que a ativação do PAR1 pela transcrição do TWIST1 leva à supressão da via Hippo. Após a ativação do PAR1, outros recetores acoplados à proteína G, como o G12/13 são ativados, estimulando a Rho GTPase, a qual inibe a cinase LATS1/2 de fosforilar o YAP1. Esta interação permite que o YAP1 se desloque para o núcleo e forme um complexo com o TEAD4, iniciando a transcrição de genes associados a EMT. Por esta via, a regulação da via Hippo pelos EMTa-TFs emerge como um mecanismo crucial para a progressão do cancro e metástases. Portanto, os EMTa-TFs podem potencialmente estabelecer uma conexão entre a CFTR disfuncional e a EMT, pelo menos parcialmente. Contudo, ainda é um desafio compreender completamente como a disfunção da CFTR causa alterações celulares tão significativas como as que se observam durante a EMT. Com base no exposto acima, o principal objetivo deste projeto de mestrado foi aprofundar os mecanismos pelos quais a disfunção da CFTR se relaciona com a EMT com ênfase na identificação de novas proteínas e vias de sinalização envolvendo estas duas proteínas. Os resultados deste projeto mostram que a quantidade proteica dos TFs YAP1 e TWIST1 se encontra elevada em células polarizadas que expressam quer a p.Phe508del- quer a p.Gly551Asp-CFTR CFBE quando comparadas com células que expressam a wt-CFTR. Adicionalmente, o knock-down de TWIST1 aumentou a quantidade proteica de TEAD4 em células CFBE wt- e p.Phe508del-CFTR. Curiosamente, a inibição da interação do YAP1 com o TEAD4, utilizando um inibidor específico, não afetou a expressão, mas sim o resgate farmacológico da p.Phe508del-CFTR. Também a co-imunoprecipitação (Co-IP) de CFTR e TWIST1 revelou uma associação entre ambas as proteínas, quer em células que expressam a wt- quer a p.Phe508del-CFTR. Finalmente, a análise por espetrometria de massa dos complexos proteicos obtidos após Co-IP identificou um interactoma do TWIST1, o qual foi comparado com o interactoma da EMT e CFTR. Esta análise permitiu gerar uma rede proteica identificando Fibronectina 1 (FN1) e Queratina18 (KRT18) como possíveis mediadoras associando a CFTR com o TF TWIST1. Em conclusão, os resultados aqui obtidos contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares da EMT induzida pela disfunção da CFTR.Cystic Fibrosis (CF) is a genetic disease caused by variants in the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) gene encoding a Cl- /HCO3 - channel expressed at the apical plasma membrane (PM) of epithelial cells. Besides its function as an anion channel, CFTR has been associated to other cellular processes, including epithelial differentiation/polarization, proliferation, and epithelial-mesenchymal transition (EMT). Cells undergoing EMT lose their epithelial properties, including cell-cell junctions, apical-basal polarity, cell shape and cytoskeleton organization while acquiring features of mesenchymal cells such as front-rear polarity and cell individualization. Recent findings have shown that CF cells actively undergo a partial EMT involving EMT-associated transcription factors (EMTa-TFs), such as YAP1, TEAD4, and TWIST1, potentially linking EMT with dysfunctional CFTR. However, it is still unknown how CFTR dysfunction can drive such major cellular alterations as those occurring in EMT. This MSc project aimed at increasing the mechanistic understanding of how dysfunctional CFTR can induce EMT, focusing on EMTa-TFs TWIST1, TEAD4, and YAP1. Our results show that YAP1 and TWIST1 protein levels increased in polarized p.Phe508del- and p.Gly551Asp-CFTR CFBE cells when compared to wt-CFTR expressing cells. The knock-down of TWIST1 increased TEAD4 protein levels in wt- and p.Phe508del-CFTR CFBE cells. Interestingly, inhibiting the interaction of YAP1 with TEAD4, using a specific inhibitor, affected not the expression but rather the pharmacological rescue of p.Phe508del-CFTR. Moreover, co-immunoprecipitations (CoIP) pulling-down CFTR and TWIST1 revealed an association between both proteins in wt- and p.Phe508del-CFTR expressing cells. Mass spectrometry (MS) analysis of the Co-IP protein complexes revealed a TWIST1 interactome, which was then intersected with the EMTome and CFTR interactome. These analyses allowed us to generate a protein network identifying Fibronectin 1 (FN1) and Keratin18 (KRT18) as possible mediators connecting CFTR with TWIST1. In conclusion, our findings have shed more light on proteins involved in CFTR-induced EMT.engFibrose quísticaCFTRTransição epitelial-mesenquimal (EMT)TWIST1Fatores de transcriçãoTeses de mestrado - 2024master thesis203683366