Tenreiro, Rogério Paulo de Andrade, 1955-Chambel, Lélia Mariana Marcão, 1964-Lemsaddek, Abdelhak, 1976-2010-07-272010-07-272008http://hdl.handle.net/10451/1636Tese de doutoramento, Biologia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2009As dermatofitias são provocadas por diversas espécies de dermatófitos constituindo uma das infecções mais comuns no mundo. Ao nível fenotípico, os fungos responsáveis por estas infecções apresentam semelhanças morfológicas entre isolados de espécies distintas, variabilidade intra-específica e pleomorfismos, tornando a sua identificação laboriosa e restrita a micologistas especializados. A aplicação de métodos moleculares permitirá uma identificação mais rápida e fidedigna destes fungos. No presente trabalho, a amplificação e restrição das regiões TR e ITS do rDNA (ARDRA) e PCR fingerprinting', utilizando os primers' (GTG)5, (GACA)4 e csM13, foram avaliados quanto ao seu potencial identificativo e de diferenciação. Após análise da região TR não se revelaram quaisquer polimorfismos entre os isolados analisados, enquanto a região ITS permitiu confirmar a identificação de oito das 14 espécies incluídas neste estudo. A utilização dos primers' (GACA)4 e csM13 permitiu o reconhecimento de padrões espécie-específicos, tornando possível a identificação de 12 das 14 espécies estudadas. Simultaneamente, os dados de PCR-fingerprinting' revelaram diferenças intra-específicas permitindo agrupar os isolados de algumas espécies em diferentes tipos genómicos. Paralelamente, foi efectuado um screening' de duas famílias de genes codificando para metaloproteases e proteases de subtilisina, putativamente relacionados com a virulência/patogenicidade dos dermatófitos, e todas as espécies em análise possuem pelo menos um dos genes pesquisados, estando uma maior incidência dos mesmos relacionada com o seu nicho ecológico preferencial, o Homem e os animais. A sensibilidade dos dermatófitos a agentes antifúngicos, habitualmente utilizados na terapêutica em Portugal, foi igualmente testada. Desenvolveu-se uma metodologia baseada no crescimento dos fungos em meio agarizado contendo um gradiente de concentração dos antifúngicos a testar. Os valores de CMI (Concentração Mínima Inibitória) revelaram que todos os isolados analisados são susceptíveis aos agentes testados. No entanto, não se pode concluir que a utilização desses antifúngicos produziria resultados idênticos na terapia, devido a factores inerentes aos próprios pacientes.Dermatophytes include several fungal species responsible for common infections in humans and animals known as dermatophytosis. The identification of the etiological agents requires specialized mycologists since it relies on phenotypic characteristics that may be shared between distinct species, while isolates from the same taxonomic group can show pleomorphisms and intraspecific variation. So, the optimization and implementation of molecular-based methodologies can turn the identification procedure faster and more accurate. In this study, in order to evaluate the identification and typification potential, amplification and restriction of TR and ITS regions of the rDNA (ARDRA) and PCR-fingerprinting, using primers (GTG)5, (GACA)4 and csM13, were applied to a collection of 233 dermatophytes. Results from the amplification and subsequent restriction of the TR region of the rDNA detected no differences among the isolates, while application of the same approach for the ITS region allowed the identification of eight of the 14 species under analysis. PCR-fingerprinting allowed for the clustering of the isolates in distinct genomic types due to intra-specific variability and profiles obtained with (GACA)4 and csM13 primers showed species-specific patterns leading to the identification of 12 out of 14 dermatophyte species. The isolates were also screened for the presence of two gene-families, coding for metalloand subtilisin proteases, potentially associated with virulence/pathogenicity within this group of organisms. Results revealed the presence of at least one of the assayed genes with a higher incidence being observed for anthropophylic and zoophylic species. The susceptibility of the dermatophytes to several antifungal agents, usually applied as therapeutical drugs in Portugal, was also evaluated. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was determined using Sabouraud antifungal gradient plates and the analyzed isolates were found to be susceptible to all the assayed antifungals. However, due to intrinsic patient-related factors, similar effects may not be observed after application of these drugs in therapy.application/pdfporDermatófitosIdentificaçãoTipificaçãoVirulênciaResistência a antifúngicosTeses de doutoramento - 2009doctoral thesis