Tavares, Ana TeresaCarlos, Ana Rita Cabral MartinsMadureira, Tomás de Oliveira2024-03-1320242023http://hdl.handle.net/10451/63404Tese de Mestrado, Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA hematopoiese é um processo que ocorre desde a embriogénese e até à vida adulta de todos os animais vertebrados. Ao longo dos anos o peixe-zebra tem-se tornado um modelo muito utilizado para estudar a hematopoiese, uma vez que apresenta vantagens que facilitam o estudo do seu desenvolvimento, tais como a fertilização externa e a transparência dos embriões. Adicionalmente, os genomas do peixe-zebra e dos mamíferos apresentam uma elevada similaridade, a qual também se observa em numerosos genes associados a doenças. Para além disso, há também uma grande homologia nos mecanismos genéticos e regulatórios que controlam a hematopoiese no peixe-zebra e nos mamíferos, apesar deste processo ocorrer em tecidos e órgãos distintos. Durante o desenvolvimento embrionário dos peixes, a primeira onda de hematopoiese dá origem aos eritrócitos primitivos, que levam oxigénio aos tecidos embrionários, e aos macrófagos primitivos, que migram para diferentes localizações no embrião onde se diferenciam em macrófagos residentes de tecidos. No sistema nervoso central, estas células são definidas como microglia. A segunda onda de hematopoiese ocorre numa fase mais tardia do desenvolvimento, e é responsável pela formação de células hematopoiéticas estaminais progenitoras, que migram para diferentes tecidos e estabelecem-se como células hematopoiéticas estaminais na medula do rim do peixe-zebra, o tecido equivalente à medula óssea dos mamíferos. É neste tecido que as células hematopoiéticas estaminais dão origem às várias linhagens celulares do sangue durante toda a vida do organismo, tais como os eritrócitos, monócitos, granulócitos e linfócitos. Na maioria dos órgãos, os macrófagos residentes de tecidos, de origem primitiva, são gradualmente substituídos por macrófagos definitivos derivados de monócitos, com origem em células hematopoiéticas estaminais. Devido às diferentes origens dos macrófagos residentes de tecidos, defeitos genéticos em qualquer uma dessas populações podem ter consequências distintas para o desenvolvimento hematopoiético do organismo. Distúrbios no normal desenvolvimento dos macrófagos primitivos levam a defeitos nos macrófagos residentes de tecidos embrionários, os quais podem afetar o desenvolvimento dos órgãos onde estes se localizam. Um destes órgãos é o cérebro, cujo normal desenvolvimento depende em grande medida da atividade da microglia primitiva. Por outro lado, se o defeito ocorrer nas células hematopoiéticas estaminais, os macrófagos definitivos podem não se desenvolver normalmente, o que compromete a imunidade inata do organismo adulto. Alterações no desenvolvimento hematopoiético podem levar a distúrbios relacionados com o sistema imunitário, tais como as perturbações do espetro do autismo (PEA) e as imunodeficiências primárias (IDP). Nomeadamente, mutações em genes que regulam a função e/ou o desenvolvimento da microglia têm sido associadas a defeitos no neurodesenvolvimento e a PEA. É de notar que a microglia desempenha funções essenciais para o normal desenvolvimento do cérebro, tais como a regulação da neurogénese e da apoptose neuronal, a fagocitose de células mortas, a poda sináptica e a remodelação de circuitos neuronais. As PEA são doenças do neurodesenvolvimento caracterizadas por defeitos na interação social e a presença de comportamentos ou interesses repetitivos e restritos. Dentro deste espetro, os cinco principais tipos são: a Perturbação Autística, a Síndrome de Asperger, a Perturbação Desintegrativa da Segunda Infância, a Síndrome de Rett e a Perturbação Global de Desenvolvimento sem outra especificação. Por outro lado, mutações que afetam o desenvolvimento das células hematopoiéticas estaminais podem comprometer o desenvolvimento e/ou a função do sistema imunitário, como ocorre nas IDP. As IDP são um grupo heterogénio de doenças crónicas causadas por mutações de novo ou hereditárias e com diversos fenótipos provocados por defeitos imunes, tais como infeções recorrentes, autoimunidade, inflamação aberrante e aumento do risco de doenças hematológicas malignas. Em particular, as IDP associadas a deficiências nos macrófagos são as seguintes: a Doença Granulomatosa Crónica, a Suscetibilidade Mendeliana a Infeções Micobacterianas e a Síndrome da Cinase de 3- Fosfoinositol δ Ativada. Neste projeto, abordamos o papel de um gene implicado em PEA e IDP que é expresso nos progenitores das células hematopoiéticas, o gene DIPK2B (Divergent Protein Kinase Domain 2B; também conhecido por DIA1R, Deleted in Autism 1 Related). A proteína DIPK2B possui um péptido sinal na região N-terminal seguido de um possível local de clivagem, indicando assim que esta proteína será translocada para o retículo endoplasmático e transportada para o aparelho de Golgi. Adicionalmente, as proteínas DIPK2B têm um domínio de proteína quinase PIP49_C altamente conservado, característico da família de proteínas quinases FAM69. Contudo, não possuem um domínio catalítico conservado, sugerindo que DIPK2B pode ser uma cinase atípica ou uma pseudocinase. Deleções e duplicações do gene DIPK2B foram encontradas em pacientes que apresentam fenótipos associados a PEA, enquanto mutações pontuais neste gene foram encontradas em pacientes com IDP. Estudos efetuados no passado por investigadores do nosso laboratório mostraram que embriões de peixe-zebra com knockdown de dipk2b apresentavam um nível de expressão superior de marcadores de células percursoras hematopoiéticos e um nível de inferior de marcadores de células hematopoiéticas diferenciadas relativamente aos seus controlos. Adicionalmente, estudos de quantificação da microglia no cérebro de larvas homozigóticas mutantes para este gene apresentavam um menor número de células da microglia do que os respetivos controlos. Estes resultados, bem como a implicação do gene DIPK2B em patologias como as PEA e IDP, sugerem que este gene restringe o número de células precursoras hematopoiéticas e promove a sua diferenciação em macrófagos e microglia. Neste projeto, pretendemos investigar o papel do gene dipk2b no desenvolvimento hematopoiético do peixe-zebra. Para isso, avaliamos o efeito do knockout deste gene na viabilidade de embriões e adultos através de uma análise das razões Mendelianas dos descendentes de cruzamentos de mutantes heterozigóticos. Esta análise revelou que dipk2b não parece ser essencial para a viabilidade do peixe-zebra. Concomitantemente, o efeito do knockout de dipk2b no desenvolvimento de diferentes populações hematopoiéticas foi avaliado através da análise de imagens de microscopia confocal e citometria de fluxo de embriões transgénicos que expressam proteínas fluorescentes especificamente nessas populações. Nomeadamente, a linha Tg(gata1a:DsRed);dipk2b foi utilizada para avaliar o efeito do knockout deste gene na população de progenitores eritromielóides, enquanto a linha Tg(mpeg:LRLG);dipk2b foi usada para estudar o papel deste gene no desenvolvimento dos macrófagos. Neste estudo não foram encontradas alterações na população de progenitores eritromielóides, apesar de estudos anteriores de investigadores do nosso laboratório terem mostrado que o gene dipk2b possa restringir o tamanho da população destas células. No entanto, o número de macrófagos é significativamente inferior nos mutantes homozigóticos quando comparados com os respetivos controlos. Assim, na fase embrionária, o papel deste gene parece consistir em promover o desenvolvimento dos macrófagos. Adicionalmente, foi também avaliado o efeito do knockout de dipk2b nas principais populações hematopoéticas de peixes adultos. Em particular, foram avaliadas as percentagens das populações de eritrócitos, linfócitos, mielomonócitos e precursores hematopoiéticos localizadas no sangue periférico, no baço e no rim de peixes adultos. Esta análise revelou que, no geral, as populações hematopoiéticas do rim e do sangue não parecem estar alteradas em mutantes para dipk2b, mas os baços de mutantes apresentam uma maior percentagem de mielomonócitos do que os de animais controlo. Este fenótipo recapitula alguns dos defeitos observados num modelo de peixe-zebra para leucemia mieloide aguda, uma neoplasia maligna hematopoiética frequentemente encontrada em pacientes com IDP. De modo geral, os nossos resultados sugerem que o dipk2b tem um papel importante no desenvolvimento hematopoiético da linhagem mieloide, promovendo o desenvolvimento dos macrófagos. Esta investigação contribui assim para esclarecer a função do gene DIPK2B na patogénese de subtipos de PEA e IDP relacionados com a disfunção de macrófagos.Hematopoiesis is a process that starts during embryogenesis and continues throughout adult life. In the embryo, a first wave of hematopoiesis gives rise to primitive erythrocytes, which oxygenate the embryonic tissues, and to primitive macrophages, which migrate into the tissues and become tissue-resident macrophages, such as the microglia in the brain. A second wave of hematopoiesis occurs later in development and is responsible for generating hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) that persist throughout an organism's life, giving rise to all blood cell lineages. Disruptions in hematopoietic development can lead to immune-related disorders, such as autism spectrum disorders (ASD) and primary immunodeficiencies (PID). Namely, genetic mutations that affect the development of microglia have been associated with defects in neurodevelopment and ASD, whereas those affecting the development of HSPCs have been associated with immune disorders and PID. In this project, we addressed the role of a gene implicated in ASD and PID that is expressed in the progenitors of hematopoietic cells, the gene DIPK2B (Divergent Protein Kinase Domain 2B). In particular, we investigated the effects of dipk2b loss of function in the hematopoietic development of zebrafish. In transgenic embryos expressing fluorescent proteins in different hematopoietic populations, we used confocal microscopy and flow cytometry to assess the number of erythromyeloid progenitors and macrophages. Our results showed that dipk2b mutant embryos have less macrophages then their respective controls. In adult zebrafish, we used flow cytometry to quantify the percentages of different hematopoietic cell populations in the peripheral blood, spleen and kidney marrow. In dipk2b mutant fish, the blood and kidney hematopoietic cell populations appeared unchanged, but the spleen had a significantly higher percentage of myelomonocytes than controls. Overall, our findings suggest that dipk2b plays a crucial role in the development of myeloid cells, which may underly its implication in ASD and PID.engHematopoiesePerturbações do Espetro do AutismoImunodeficiências Primáriasdipk2bPeixe-ZebraTeses de mestrado - 2024master thesis203606116