Brito,Maria Luísa Lopes de Castro eMendes,Carla RaquelTavares,Mariana Frade2026-05-282026-05-282025-11-28http://hdl.handle.net/10400.5/118798Dissertação de Mestrado, Engenharia Alimentar, 2025, Universidade de Lisboa, Instituto Superior de Agronomia.O queijo é um dos alimentos mais antigos da humanidade. Portugal destaca-se como um dos países com maior tradição de produção e consumo deste alimento, especialmente queijos feitos com leite cru que, não sendo o leite submetido a um processo de tratamento térmico, apresentam maior risco em termos de segurança deste alimento. Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) é uma bactéria patogénica de origem zoonótica, que pode contaminar o leite durante o processo de ordenha e, consequentemente, o queijo. Devido à sua dose infeciosa ser baixa (10-100 UFC) e à gravidade da doença que pode provocar, STEC representa um desafio significativo para a Segurança dos Alimentos. Este estudo teve como objetivo verificar a prevalência dos genes stx1 e/ou stx2 de STEC em queijos de leite cru, fabricados em Portugal, aplicando o método descrito na norma em desenvolvimento ISO/DIS 13136-1:2025. Apesar da deteção destes genes em cinco das 22 amostras analisadas, não foi possível a confirmação dos resultados, devido à incapacidade de isolar o microrganismo alvo, evidenciando-se assim a necessidade de otimização deste método. Os resultados mostraram que os meios de cultura utilizados para o isolamento de colónias não foram eficazes. O meio cromogénico CHROMagar™STEC, dito seletivo, permitiu o crescimento de colónias com aspeto característico de STEC, mas que não se confirmaram como tal. Enquanto o meio TBX, por não ser seletivo para STEC, não permitiu fazer a distinção entre o microrganismo alvo e outros tipos de E. coli. A presença de E. coli não-STEC e de outras enterobactérias nos queijos analisados gerou competição por nutrientes durante o enriquecimento, dificultando a recuperação de STEC e, consequentemente, impedindo a obtenção de colónias isoladas. A inclusão de etapas com recurso a técnicas como a separação imunomagnética e o desenvolvimento de meios de cultura mais seletivos podem apresentar-se como solução às limitações evidenciadas.Cheese is considered one of the oldest foods in human history. Portugal stands out as one of the countries with the longest tradition of producing and consuming this food, particularly raw milk cheeses, which, because they are not subjected to a heat treatment process, present a greater risk in terms of food safety. Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) is a pathogenic microorganism of zoonotic origin that can contaminate milk during the milking process and, consequently, cheese. Due to its very low infectious dose (10-100 CFU) and the severity of the disease it can cause, STEC represents a significant challenge to food safety. This study aimed to verify the prevalence of the STEC stx1 and/or stx2 genes in raw milk cheeses produced in Portugal, applying the method described in the ISO/DIS 13136-1:2025 standard under development. Despite the detection of these genes in five of the 22 analyzed samples, confirmation of the results was not possible due to the inability to adequately isolate the target microorganism, emphasizing the need for further optimization of the method. These findings demonstrated that the culture media used for colony isolation are not very effective. CHROMagar™ STEC medium, although selective and chromogenic, allows the growth of colonies with the same characteristic appearance as STEC, but which are confirmed not to be STEC. TBX medium, because it is not selective for STEC, does not allow for the distinction between this target microorganism and other types of E. coli. The presence of non-STEC E. coli and other enterobacteriaceae in the analyzed cheeses creates competition for nutrients during enrichment, hindering STEC recovery and, consequently, preventing the obtaining of isolated colonies. The inclusion of steps using techniques such as immunomagnetic separation and the development of more selective culture media may offer solutions to the limitations identified.application/pdfporSTECqueijos de leite cruMultiplex PCRCHROMagar™ STECsegurança dos alimentos (food safety)raw milk cheesesFood safetymaster thesis204307570