Wieringa, PaulCarvalho, Margarida Henriques da GamaCoimbra, Tomás Santos2025-01-292025-01-2920242024http://hdl.handle.net/10400.5/97938Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO intestino é um órgão fundamental para manter a homeostase no organismo humano. Por detrás deste fenómeno está a complexa interseção entre o sistema nervoso e o sistema imunitário, que conjuntamente promovem a integridade da barreira intestinal e protegem contra agentes patogénicos, presentes no lúmen do intestino. No caso de desregulação de qualquer um destes sistemas, várias doenças do foro gastrointestinal podem emergir, particularmente doenças inflamatórias crónicas como a doença inflamatória intestinal. Apesar da reconhecida importância da interação neurointestinal, a forma como a inflamação afeta a resposta das células epiteliais a estímulos do sistema nervoso não é completamente compreendida. Um dos maiores desafios que impede o progresso no estudo destas interações consiste na escassez de modelos in vitro avançados que incluam componentes do sistema nervoso periférico (SNP) e que sejam fisiologicamente relevantes. Este estudo teve como principal objetivo explorar as interações neuro-epiteliais no intestino utilizando dois modelos in vitro distintos: um modelo simples e reconhecido de monocamada com células Caco2, onde foram usados neuropéptidos para simular o SNP, e um modelo tridimensional (3D) de órgãoem-chip, desenvolvido no nosso laboratório, que incorporou neuroesferas periféricas derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs). Para simular diferentes fases da resposta inflamatória em ambos os nossos modelos in vitro, utilizámos diferentes combinações (ou cocktails) de citocinas pró- e anti-inflamatórias que representaram os estados de homeostase, fase inflamatória aguda, fase inflamatória intermédia e resolução da inflamação. Inicialmente, validámos o modelo bidimensional (2D) com células Caco-2 para garantir a recapitulação da resposta epitelial aos cocktails inflamatórios. De seguida, explorámos o efeito de neuropéptidos do SNP nesse mesmo modelo em diferentes fases da inflamação. As diferenças entre as duas isoformas (alfa e beta) do péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), previamente desconhecidas, tornaram-se particularmente evidentes nos nossos resultados. Enquanto que a variante alfa teve um papel protetor na barreira intestinal, a variante beta demonstrou efeitos mais intensos na modulação de processos como permeabilidade e transporte epitelial, dependendo do estado inflamatório. Esta descoberta desafia a ideia estabelecida de que estas isoformas têm a mesma função biológica. Outros neuropéptidos, como a substância P (SP), o péptido intestinal vasoativo (VIP) e o neuropéptido Y (NPY), também desempenharam papéis distintos na modulação da função intestinal. A SP foi associada à disrupção das tight junctions, aumentando a permeabilidade, e à redução de espécies reativas de oxigénio. O VIP, embora conhecido pelos seus efeitos anti-inflamatórios, demostrou efeitos mistos, influenciando tanto a integridade da barreira epitelial como a produção de mediadores inflamatórios. Isto ocorreu, possivelmente, devido à falta de interação com células imunitárias, que não estão representadas no modelo in vitro 2D limitado a células Caco-2. Já o NPY, amplamente expresso por neurónios simpáticos e entéricos, também afetou a permeabilidade intestinal, mas não teve qualquer efeito na redução de stress oxidativo ou na expressão de recetores de citocinas pró-inflamatórias. Paralelamente, também desenvolvemos um modelo in vitro órgão-em-chip do intestino com inervação periférica. Para incluir componentes do SNP neste modelo, otimizámos um protocolo desenvolvido no nosso grupo de investigação que permite obter neuroesferas de nociceptores através de hiPSCs. Como os neurónios nociceptores e autónomos partilham uma espécie intermédia no seu desenvolvimento, a crista neural do tronco, focámo-nos em direcionar a diferenciação desta espécie para a linhagem autonómica. Desta forma, seria possível incluir ambos os ramos do sistema periférico, somático e autónomo, neste modelo in vitro do intestino e ter uma perspetiva mais abrangente da regulação de processos intestinais pelo SNP. Na otimização do protocolo, testámos oito combinações diferentes de ativadores de duas vias de sinalização cruciais para a formação dos neurónios de interesse. Estas combinações envolveram o uso de fatores de crescimento e moléculas pequenas sintéticas em várias concentrações, que permitiram diferentes níveis de ativação das vias de sinalização de interesse (baixo, moderado e alto). Através de PCR quantitativo em tempo real e imunofluorescência, caraterizámos a morfologia das neuroesferas produzidas, bem como a expressão de marcadores clássicos de neurónios autonómicos e de outras linhagens neuronais potencialmente contaminantes. Com base nos resultados obtidos, optámos por escolher o protocolo com duas moléculas pequenas, SB4 e purmorfamina, dado que este tratamento resultou em neuroesferas mais estruturalmente consistentes e com maior crescimento de axónios. Adicionalmente, demostraram menor expressão de genes de outras linhagens neuronais e maior expressão de genes autonómicos, quer de fase inicial, quer de fase terminal. Posteriormente, montámos o nosso modelo intestino-em-chip. Este modelo consistiu num dispositivo microfluídico fabricado em dimetilpolissiloxano, ao qual foi fixada uma lamela de vidro na parte inferior. Este dispositivo era composto por dois compartimentos secundários, cuja função era reservar e fornecer meio de cultura às células, e um compartimento principal com um hidrogel de colagénio tipo I. Neste hidrogel foi inserida uma agulha para formar um canal, onde foram posteriormente plaqueadas as células Caco-2. Após alguns dias de cultura, as células atingiram confluência e preencheram a totalidade do tubo cilíndrico, formando tight junctions de forma semelhante ao que acontece in vivo. No hidrogel de colagénio, incorporámos também as neuroesferas nociceptivas e autonómicas derivadas de hiPSCs para simular a inervação do tecido intestinal in vitro. Apesar de fisicamente separados, os compartimentos neuronal e epitelial permitiram a interação célulacélula após a maturação dos neurónios e formação de axónios. Esta separação permitiu também o isolamento de ácido ribonucleico (RNA) do tubo epitelial com contaminação mínima de RNA neuronal, e a visualização de ambos os compartimentos isoladamente (e a sua interação) com o microscópio de fluorescência. Dado que ambos os tipos de neuroesferas utilizados foram geneticamente modificados para expressarem proteínas fluorescentes, foi possível fazer esta visualização sem recurso a marcação com anticorpos fluorescentes. No entanto, observámos que os neurónios sensoriais não emitiram sinais de fluorescência na região dos axónios, o que indica que a modificação genética das células requer melhorias para permitir a visualização de ambos os compartimentos neuronais. Após desenvolver o modelo in vitro em 3D, validámos a expressão de marcadores de diferenciação e função intestinal, o que revelou o efeito prejudicial de reduzir o tempo de diferenciação das células Caco-2 de três para duas semanas. Para além disso, o processo de validação também evidenciou o efeito de duplicar a concentração das citocinas pró- e anti-inflamatórias. Apesar de ser necessário para induzir uma resposta nas neuroesferas presentes no hidrogel, este aumento alterou processos biológicos nas células epiteliais que estavam em contacto direto com o meio de cultura. Apesar destes desafios, prosseguimos com a avaliação dos efeitos dos cocktails inflamatórios nas células epiteliais, em chips com e sem inervação periférica. A presença de neuroesferas do SNP teve efeitos ligeiros na alteração da generalidade dos processos intestinais, mas demostrou alterações significativas no aumento da expressão de interleucina 8. Isto sugere que a interação entre os neurónios e as células epiteliais pode estimular o recrutamento de células imunitárias, como neutrófilos, em fases de resolução da inflamação. A ausência de diferenças significativas nestes ensaios pode advir da falta de estimulação (química ou optogenética) das neuroesferas autonómicas, como ocorre in vivo por meio do sistema nervoso central, sendo que estudos futuros devem ter este aspeto em conta. Em suma, este trabalho destaca o papel essencial dos neuropéptidos na regulação da fisiologia do intestino, bem como o potencial de modelos in vitro avançados, como intestino-em-chip com inervação, para estudar estes processos sem recorrer a modelos animais. No futuro, a incorporação de células imunes e um componente vascular, aliado ao refinamento dos componentes epiteliais e neuronais existentes, deve ser considerada para melhorar a relevância fisiológica do modelo. Através de investigação e desenvolvimento adicional destes modelos avançados, será possível compreender melhor as interações neuro-imunitárias e a sua influência na saúde e doença gastrointestinal, de uma forma ética, reprodutível, escalável e com um custo-benefício vantajoso.The intestine plays a critical role in maintaining homeostasis through complex interactions between the epithelium, nervous and immune systems. Although this interplay regulates several gut processes, how inflammation affects the response of epithelial cells to neural stimuli is not fully understood. One major challenge in studying these interactions is the limited incorporation of relevant peripheral nervous system (PNS) components in advanced in vitro models. To address this, we explored neuro-epithelial interactions using two in vitro models: the well-established Caco-2 monolayer, where neuropeptides mimicked PNS inputs, and a 3D gut-on-a-chip platform, developed in-house, incorporating human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived PNS neurospheres. Distinct phases of inflammation were simulated by applying cytokine cocktails representing homeostasis, acute inflammation, intermediate inflammation, and resolution. We found distinct differences between the two calcitonin gene-related peptide isoforms: the alpha variant showed anti-inflammatory and barrier tightening effects, while the beta variant showed a stronger effect in modulating intestinal permeability and transport. These findings challenge the established idea that they are biologically identical. Other neuropeptides (substance P, vasoactive intestinal peptide and neuropeptide Y) also modulated several gut processes, with varying effects depending on the inflammatory context. In the 3D system, tight junctions and cytokine receptor expression was more similar to the in vivo environment. By fine-tuning a differentiation protocol from hiPSCs, we successfully integrated functional PNS neurospheres, from both sensory and autonomic lineages, into the model. This generally led to subtle effects on intestinal function in vitro, but a marked increase in IL-8 expression in anti-inflammatory conditions. This study highlights the critical role of neuropeptides in controlling gut function during inflammation and demonstrates the potential of innervated 3D gut-on-a-chip models as platforms for studying neuro-epithelial crosstalk. Future work incorporating immune and vascular components, while refining the current epithelial and neural components, will further enhance the physiological relevance of these models.engIntestinoInflamaçãoSistema nervoso periféricoModelos in vitroÓrgão-em-chipTeses de mestrado - 2024master thesis203880315