Mira, Nuno P.Barata, Margarida,1958-Novais, Danielle de Sotti2018-01-242019-10-2820172017http://hdl.handle.net/10451/30904Tese de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2017Nos últimos anos tem-se verificado um aumento significativo na incidência de infeções causadas por espécies do género Candida, entre outras razões, devido ao aumento significativo da população imunocomprometida 1 2 3. C. albicans é a principal espécie causadora de infeções fúngicas, que variam desde infeções superficiais nas mucosas até infeções sistémicas, potencialmente letais. No entanto, nos últimos tempos tem-se verificado um aumento significativo nas infeções originadas por outras espé-cies do género Candida, geralmente conhecidas por NCAC (Non-Candida albicans Candida species) 1. Entre estas, C. glabrata tem emergido de forma particular sendo a segunda principal espécie causa-dora de infeções fúngicas invasivas 8 9, com uma taxa de letalidade a rondar os 40 % 10 11. A emergên-cia de estirpes NCAC (e, particularmente, de C. glabrata) resistentes a azóis, os principais antifúngicos usados na prática clínica 1, tem contribuído de forma significativa para a mudança da etiologia observada nas infecções causadas por Candida. Os azóis têm como alvo a enzima citocromo P45014DM envolvida na biossíntese de ergosterol 22 23. Em C. glabrata esta enzima é codificada pelo gene ERG11 e a inibição desse gene pelos azóis sabe-se levar à diminuição da síntese do ergosterol o que resulta na concomitante acumulação de esteróis metilados na posição 14α, altamente tóxicos para célula por levarem a alterações significativas na integridade da membrana plasmática 22 23 25. Um dos principais mecanismos de resistência aos azóis observado em estirpes clínicas de C. glabrata é a sobre-expressão de genes que codificam transportadores de múltiplas drogas pertencentes à Superfamília ABC (ATP-binding cassette) como sejam Cdr1 ou Cdr2 29. Um dos mecanismos moleculares subjacentes à sobre-expressão dessas bombas de efluxo em isolados clínicos resistentes está relacionada com aparecimento de mutações ganho de função no gene que codifica o factor de transcrição Pdr1 68. Vários estudos têm reportado diferentes mutações de ganho de função no gene CgPDR1 47 68 70 73 80, mutações estas que conduzem a uma ativação constante do regulador mesmo na ausência de qualquer droga. Estas mutações localizam-se em vários domínios da proteína incluindo o domínio de regulação (e.g. R376W e L328F) ou o domínio de ativação (e.g. D1082Q e E1083Q). A identificação destas mutações de ganho de função reveste-se de especial importância para tornar mais rápida a identificação de pacientes que possam estar colonizados com estirpes que serão intrinsecamente resistentes a azóis e que, portanto, vão necessitar de ser tratados com outro tipo de antifúngicos aos quais o regulador CgPdr1 não responde. Neste trabalho foram comparadas as sequências codificantes do gene CgPDR1 de um conjunto de isolados clínicos de C. glabrata resistentes a fluconazol e voriconazol, com a sequência da estirpe de referência CBS138 que se sabe ser sensível a estes mesmos azóis. Na sequência dessa análise foram identificadas duas mutações, I392M e R35K, como possíveis candidatas a corresponderem a novas mutações de ganho de função de CgPDR1. Tal hipótese é suportada pelo fenótipo de resistência dos isolados clínicos e também pelo facto de se observar uma sobre-expressão dos genes CgCDR1 e CgPUP1 nesses mesmos isolados, por comparação com os níveis de expressão observados na estirpe CBS138. A substituição de aminoácido I392M está localizada no domínio regulatório inibitório (localizado entre os resíduos 322-465), pelo que é possível que a alteração da isoleucina para a metionina resulte, de uma alguma forma, numa redução da inibição deste domínio permitindo assim aumentar a atividade de CgPdr1. Este domínio regulatório verificou-se também conter o domínio de ligação a xenobióticos, uma região responsável pela ativação de CgPdr1 por ligação a drogas, incluindo azois 77. Assim, outra hipótese para uma eventual híper-ativação de CgPDR1 no mutante I392M pode resultar por uma alteração nesse domínio de ligação a drogas da proteína, fazendo um bypass à necessidade de haver ligação da droga à proteína para que ocorra ativação da mesma. A variante R35K está localizada no domínio de ligação ao DNA do CgPDR1 (localizado entre os resíduos 26 e 59) e está responsável pela ligação do regulador ao motivo de DNA PDRE (Pleiotropic drug resistance element) encontrada na região promotora dos genes alvos 75. Até ao momento não foram descritas variantes de CgPdr1 hiper-ativas com alterações no DBD de CgPDR1, pelo que serão necessários mais estudos para avaliar de que forma a mutação R35K contribui para uma híper-activação de CgPdr1. A constante emergência de estirpes resistentes a azóis torna essencial o desenvolvimento de novas moléculas com potencial antifúngico mas que tenham alvos de acção diferentes dos azóis, para ser assim possível sensitizar estirpes resistentes. Nesse sentido, neste trabalho foi aprofundado o estudo de um conjunto de complexos organometálicos derivados de Ag e de cânfora, recentemente demonstrados como tendo potencial antimicrobiano 87, como agentes anti-Candida e, em particular, como agentes capazes de sensitizar isolados de C. glabrata resistentes a azois. Os compostos foram obtidos usando uma combinação de nitrato de prata e derivados de cânfora, que são dois tipos de compostos com propriedades farmacêuticas reconhecidas 89 90. Os 3 compostos Ag(I)-camphorimine usados neste estudo apresentaram uma elevada atividade contra a estirpe de referência C. glabrata CBS138 (MIC na ordem de 15,63 mg/L para os compostos B e C, e 31,25 mg/L para o composto A), sendo esta atividade particularmente notória em condições de pH neutro. Os valores de MIC obtidos para os isolados clínicos resistentes a fluconazol e voriconazol foram numa gama semelhante aos dos obtidos para a estirpe de referência (na gama entre os 15,63 mg/L e os 62,5 mg/L) indicando assim uma elevada capacidade dos compostos Ag(I)-camphorimine em sensitizar as estirpes resistentes. Foi também observado que a presença dos compostos Ag(I)-camphorimine aumenta o efeito inibitório do fluconazol, incluindo nas estirpes resistentes, indicando assim um efeito sinérgico significativo. Estes dois resultados e também o facto de CgPDR1 e o seu gene alvo CgCDR1 se terem verificado ser dispensáveis para a tolerância de C. glabrata contra os compostos Ag(I)-camphorimine, indica que o mecanismo de ação destes compostos e dos azóis são diferentes. Por fim, foi observado que o efeito sinérgico obser-vado não resulta de um aumento da concentração intracelular de fluconazol nas células potenciado pela presença dos compostos Ag(I)-camphorimine. Até ao momento, o efeito inibitório de Ag(I) ou de químicos derivados de Ag(I) tem sido pouco estudado em Candida glabrata e a maior parte desses estudos tem abordado somente o uso de nanopartículas. Os estudos que mostram a atividade desses compostos indicam que existe uma inibição significativa das células sendo os principais motivos, a inibição de formação de hifas, alteração da superfície celular levando a formação de poros na célula e também a alteração da parede celular dessas estirpes 87 104 105. Por este motivo no futuro, a fim de promover a implementação dos compostos Ag(I)-camphorimine aqui estudados, como um possível tratamento da candidíase, estudos adicionais serão necessários de modo a elucidar quais os mecanismos de ação desses compostos em células de C. glabrata. Também é requerido obter informação quanto toxicidade desses químicos contra células mamíferas, tanto a nível local e sistémica. Concluindo, considerando que o atraso no diagnóstico de estirpes resistentes aos antifúngicos e posterior ajuste dos tratamentos utilizados é um dos fatores com maior impacto na determinação da taxa de mortalidade de pacientes infetados com candidíase, o conhecimento obtido neste trabalho constitui uma contribuição significativa para melhorar o sucesso da atualidade estratégias utilizadas no tratamento da candidíase.Candida glabrata is emerging as a human pathogen, being the second major cause of invasive fungal infections. Part of the success of C. glabrata as a pathogen rely on its rapid acquisition of resistance to azoles, the front line therapy used in prophylactic and active treatment of candidiasis. Acquisition of azole resistance in C. glabrata results, among other mechanisms, from alterations in the coding se-quence of the transcriptional regulator CgPdr1 that result in gain-of-function (GOF) variants of this protein that are constitutively active, even in the absence of azoles. In the present work the sequence of CgPDR1 alleles encoded by eight C. glabrata isolates found to be resistant to fluconazole and voriconazole was determined and compared with the sequence of the reference strain CBS138, susceptible to azoles. Two mutations, I392M and R35K, were identified and hypothesized to represent new gain-of-function CgPDR1 variants. CgCDR1 and CgPUP1, two known CgPdr1-targets, were found to be over-expressed in isolates FFUL412, FFUL443 and FFUL866 during growth in drug-free medium, reinforcing the idea that the identified mutations lead to constitutive activation of CgPDR1. The efficacy of a set of Ag(I)-camphorimine complexes against C. glabrata, including against azole resistant clinical isolates (including those harboring CgPDR1 GOF variants), was also examined in this work. The results obtained showed a potent effect of Ag(I)-camphorimine complexes in inhibiting growth of C. glabrata, more marked at a near neutral pH. Remarkable, the level of inhibition of the azole resistant isolates was similar to the one registered for azole susceptible strains suggesting that the mechanism of action of azoles and of Ag(I)-camphorimine differs. A synergistic effect between Ag(I)-camphorimine complexes and fluconazole in inhibiting growth of C. glabrata, including of the azole-resistant isolates was also demonstrated, a strategy that could be used to improve the efficacy of azole-based therapies in the treatment of candidiasis. Candida glabrata is emerging as a human pathogen, being the second major cause of invasive fungal infections. Part of the success of C. glabrata as a pathogen rely on its rapid acquisition of resistance to azoles, the front line therapy used in prophylactic and active treatment of candidiasis. Acquisition of azole resistance in C. glabrata results, among other mechanisms, from alterations in the coding se-quence of the transcriptional regulator CgPdr1 that result in gain-of-function (GOF) variants of this protein that are constitutively active, even in the absence of azoles. In the present work the sequence of CgPDR1 alleles encoded by eight C. glabrata isolates found to be resistant to fluconazole and voriconazole was determined and compared with the sequence of the reference strain CBS138, susceptible to azoles. Two mutations, I392M and R35K, were identified and hypothesized to represent new gain-of-function CgPDR1 variants. CgCDR1 and CgPUP1, two known CgPdr1-targets, were found to be over-expressed in isolates FFUL412, FFUL443 and FFUL866 during growth in drug-free medium, reinforcing the idea that the identified mutations lead to constitutive activation of CgPDR1. The efficacy of a set of Ag(I)-camphorimine complexes against C. glabrata, including against azole resistant clinical isolates (including those harboring CgPDR1 GOF variants), was also examined in this work. The results obtained showed a potent effect of Ag(I)-camphorimine complexes in inhibiting growth of C. glabrata, more marked at a near neutral pH. Remarkable, the level of inhibition of the azole resistant isolates was similar to the one registered for azole susceptible strains suggesting that the mechanism of action of azoles and of Ag(I)-camphorimine differs. A synergistic effect between Ag(I)-camphorimine complexes and fluconazole in inhibiting growth of C. glabrata, including of the azole-resistant isolates was also demonstrated, a strategy that could be used to improve the efficacy of azole-based therapies in the treatment of candidiasis. Candida glabrata is emerging as a human pathogen, being the second major cause of invasive fungal infections. Part of the success of C. glabrata as a pathogen rely on its rapid acquisition of resistance to azoles, the front line therapy used in prophylactic and active treatment of candidiasis. Acquisition of azole resistance in C. glabrata results, among other mechanisms, from alterations in the coding se-quence of the transcriptional regulator CgPdr1 that result in gain-of-function (GOF) variants of this protein that are constitutively active, even in the absence of azoles. In the present work the sequence of CgPDR1 alleles encoded by eight C. glabrata isolates found to be resistant to fluconazole and voriconazole was determined and compared with the sequence of the reference strain CBS138, susceptible to azoles. Two mutations, I392M and R35K, were identified and hypothesized to represent new gain-of-function CgPDR1 variants. CgCDR1 and CgPUP1, two known CgPdr1-targets, were found to be over-expressed in isolates FFUL412, FFUL443 and FFUL866 during growth in drug-free medium, reinforcing the idea that the identified mutations lead to constitutive activation of CgPDR1. The efficacy of a set of Ag(I)-camphorimine complexes against C. glabrata, including against azole resistant clinical isolates (including those harboring CgPDR1 GOF variants), was also examined in this work. The results obtained showed a potent effect of Ag(I)-camphorimine complexes in inhibiting growth of C. glabrata, more marked at a near neutral pH. Remarkable, the level of inhibition of the azole resistant isolates was similar to the one registered for azole susceptible strains suggesting that the mechanism of action of azoles and of Ag(I)-camphorimine differs. A synergistic effect between Ag(I)-camphorimine complexes and fluconazole in inhibiting growth of C. glabrata, including of the azole-resistant isolates was also demonstrated, a strategy that could be used to improve the efficacy of azole-based therapies in the treatment of candidiasis.engCgPdr1Resistência aos azóisCandida glabrataComplexos Ag(I)-CamphorimineVariantes ganho de função de CgPdr1Teses de mestrado - 2017master thesis201865815