Leitão, José Alexandre da Costa Perdigão e CameiraMartins, Carlos Manuel Lopes VieiraBasto, Afonso Silva Pinto2011-12-072011-12-072011-10Basto, A.S.P. (2011). Um novo sistema de clonagem baseado na lipoproteína OprI para obtenção de formulações imunogénicas derivadas da parede celular bacteriana. Tese de Doutoramento. Universidade Técnica de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa.http://hdl.handle.net/10400.5/3620Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Sanidade AnimalA modulação de imunidade específica por conjugação de antigénios com ligandos de receptores de reconhecimento de padrão (PRR) constitui uma estratégia emergente para o desenvolvimento de vacinas subunitárias. Neste trabalho, desenvolve-se um novo sistema de clonagem em Escherichia coli para expressão de antigénios em fusão com a lipoproteína OprI, um ligando TLR da membrana externa de Pseudomonas aeruginosa. O sistema permite um controlo apertado da expressão proteica e a purificação por cromatografia de afinidade com iões metálicos, ultrapassando as principais limitações de versões anteriores. Confirmou-se o processamento, translocação e triacilação da lipoproteína e desenvolveram-se protocolos para a produção de outras formulações recombinantes derivadas da parede bacteriana (fragmentos e vesículas de membrana externa) com potencial distinto para activação PRR. Como modelo, clonaram-se as sequências dos antigénios A104R do vírus da peste suína africana (VPSA), ovalbumina e EGFP. Demonstrou-se a capacidade adjuvante das três formulações, avaliando a resposta humoral e a indução de linfócitos T CD8+ in vivo e o perfil de citocinas e quimiocinas induzidas em células dendríticas estimuladas in vitro. Os resultados observados validam o sistema para a obtenção de formulações imunogénicas com aplicação no desenvolvimento de vacinas subunitárias experimentais e em estudos de modulação de resposta adaptativa.ABSTRACT - A new cloning system based on the OprI lipoprotein for the production of bacterial cell wall-derived immunogenic formulations - The modulation of specific immunity through the conjugation of antigens with ligands of pattern recognition receptors (PRR) is emerging as a promising strategy for the development of subunit vaccines. Here, a new Escherichia coli cloning system for the expression of antigens in fusion with the OprI lipoprotein, a TLR ligand from the Pseudomonas aeruginosa outer membrane, is described. The system offers tight regulation of expression and allows for purification by metal affinity chromatography, circumventing the major drawbacks of former versions. Lipoprotein processing, translocation and triacylation were confirmed and protocols for the productions of other recombinant bacterial cell wall-derived formulations (outer membrane fragments and vesicles) with distinct potential for PRR activation were developed. As models, the sequences coding for the antigens A104R from African swine fever virus (ASFV), ovalbumin and EGFP were cloned. The adjuvant capacity of the three formulations was demonstrated evaluating the induction of humoral and CD8+ T cells responses in vivo and the cytokine and chemokine profile induced in dendritic cells stimulated in vitro. The results observed validate the system for the production of immunogenic formulations suitable for the development of experimental subunit vaccines and for studies on the modulation of adaptive immunity.porLipoproteína I da membrana externaOprIPseudomonas aeruginosaProteínas da membrana externa bacterianaVector de clonagemImunomodulaçãoAdjuvantePadrões moleculares associados a microrganismos patogénicosVírus da peste suína africanaOvalbuminaOuter membrane lipoprotein IBacterial outer membrane proteinsCloning vectorImmunomodulationAdjuvantPathogen-associated molecular patternsAfrican swine fever virusOvalbumindoctoral thesis