Tenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952Cardoso, Maria Inês Dias, 1987-2013-11-072013-11-072013http://hdl.handle.net/10451/9483Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Aerobic anoxygenic phototrophic bacteria (AAnPB) are primarily heterotrophic organisms capable of harvesting light energy using photosynthetic reaction centres composed of bacteriochlorophyll a (BChl a), that in contrast to the related purple photosynthetic bacteria are unable to use the light for anaerobic growth and require oxygen to respire organic compounds, which are essential for growth. This functional group is present in many habitats and seems to be very abundant in estuarine waters. Although, the presence of AAnPB in estuarine water column is well established, there is little information regarding AAnPB presence in estuarine microphytobenthos (MPB) biofilms. In the current study the AAnPB abundance and diversity were investigated in MPB biofilms from Tagus estuarine intertidal sediments. Using a poliphasic approach with classical microbiology culture dependent techniques and molecular biology culture independent techniques (mainly polymerase chain reaction and temperature gradient gel electrophoresis) we evaluated AAnPB spatio-temporal patterns in three sediment types (sand, sandy mud and mud) throughout one year. AAnPB were present in all four seasons, with more abundance but less diversity in summer and fewer but more varied in cooler seasons. Higher AAnPB abundance and diversity was observed in the sandy sediment. All these observations are in accordance with the total of bacteria studied in the same way. However, contrary to total bacteria that had a pronounced seasonal effect in the formation of their communities, AAnPB could keep their community more or less stable throughout the year. Three new AAnPB isolates from Tagus intertidal sediments were placed in Roseobacter clade of phylogenetic trees using pufM gene sequence data and sequences from Gene Bank. This work shows that previously neglected AAnPB are relevant components of estuarine MPB biofilms forming in intertidal sediments.Este trabalho foca-se num grupo funcional bacteriano específico, as bactérias aeróbias anoxigénicas fototróficas (AAnP). Estas bactérias são fotoheterotróficas, utilizando substratos orgânicos como fonte de carbono e energia e a luz como uma fonte adicional de energia. Ao contrário das bactérias púrpura não-sulfúreas (PNS), um dos grupos filogeneticamente mais próximo, que apenas realizam fotossíntese na ausência de oxigénio, as bactérias AAnP não conseguem utilizar a luz como fonte primária de energia, em condições anóxicas, necessitando de oxigénio para metabolizar os compostos orgânicos que são essenciais ao seu crescimento. Estas bactérias são, primariamente, organismos heterotróficos que têm a capacidade de captar energia luminosa por possuírem sistemas fotossintéticos com bacterioclorofila a nos seus centros de reação (Yurkov & Csotonyi 2009). Embora as bactérias AAnP e PNS realizem fotossíntese anoxigénica e possuam sistemas fotossintéticos semelhantes, a pressão seletiva conduziu a uma divergência evolutiva, conferindo às AAnP a capacidade de ocupação de novos nichos ecológicos, devido à obtenção de energia por fototrofia anoxigénica em ambientes óxicos. (Rathgeber et al. 2004). Estas bactérias desenvolveram também mecanismos de controlo da fototoxicidade resultante dos danos oxidativos nas células produzidos por espécies químicas reativas (tripletos de bacterioclorofila e singletos de oxigénio) que se formam quando a bacterioclorofila a é exposta à luz na presença de oxigénio (Beatty 2002). As bactérias AAnP foram caracterizadas pela primeira vez em ambientes marinhos por Shiba e colaboradores (1979), e nos últimos anos têm sido isoladas em praticamente todo o tipo de ambientes: rios, solos, água ácida de minas, nascentes hipersalinas e ambientes marinhos abrangendo tanto as águas superficiais dos oceanos como também chaminés hidrotermais a grandes profundidades (Yurkov & Csotonyi 2009). Atendendo à ampla distribuição das bactérias AAnP nos oceanos pensou-se inicialmente (Yurkov & van Gemerden 1993; Suyama et al. 2002) que a fotoheterotrofia podia ser benéfica em ambientes pobres em nutrientes, tais como em zonas oligotróficas. Contudo, recentemente, demonstrou-se que estas bactérias são abundantes quer em ambientes eutróficos, quer em ambientes oligotróficos (Jiao et al. 2007; Yutin et al. 2007). Atualmente sabe-se que as bactérias AAnP constituem apenas no máximo 10% de todas as bactérias presentes em ambientes marinhos (Yurkov & Csotonyi 2009) sendo mais prósperas em ambientes de nível trófico mais elevado, que lhes conseguem fornecer os substratos suficientes para manter o seu metabolismo essencial, a heterotrofia, usando a fototrofia apenas como um suplemento de energia (Hojerová et al. 2011). Outros autores sugerem que a ligação a partículas (Cottrell et al. 2010; Waindner & Kirchman 2007) ou a intensidade da luz (Koblížek et al. 2010) podem influenciar a sua abundância. As bactérias AAnP existem muito frequentemente em estuários como em: Long Island Sound (Schwalbach & Fuhrman 2005), Chesapeake Bay (Waidner & Kirchman 2007; Cottrell et al. 2010) ou em Delaware Bay (Waidner & Kirchman 2007; Cottrell et al. 2010), constituindo pelo menos 10% de todos os procariotas aí existentes. Os estuários representam zonas de transição entre os biomas de água doce e marinho apresentando vários gradientes de parâmetros que diferem nesses dois ambientes (Kaiser et al. 2005). Constituem um dos ecossistemas mais produtivos do planeta, tecnologicamente importantes e são também zonas tampão contra a subida do nível da água do mar (Underwood & Kromkamp 1999). Normalmente os estuários têm zonas intertidais que são colonizadas por biofilmes microfitobênticos (MFB) que se formam na superfície dos sedimentos intertidais (Underwood 2010). Estes biofilmes, apesar de terem a sua atividade no sedimento cingida a poucos milímetros, dependendo da penetração da luz, a sua produtividade é normalmente muito elevada (Underwood & Kromkamp 1999; Underwood 2010). Os biofilmes podem ser compostos por diferentes grupos de microalgas e por cianobactérias (MacIntyre et al. 1996), sendo também espectável que incluam espécies de Proteobacteria e Bacteroidetes (Stevens et al. 2005), porque estes organismos são importantes nos ciclos de carbono e energia nos estuários. No entanto, apesar da fração das microalgas e cianobactérias estar bem explorada a presença de bactérias fotoheterotróficas nos biofilmes MFB estuarinos tem sido negligenciada. Recentemente, estudos publicados sugerem que as bactérias AAnP se encontram frequentemente associadas a partículas (Cottrell et al. 2010, Wainder & Kirchamn 2007, 2008), tendo esta associação maior relevância em ambientes estuarinos (Cottrell et al. 2010). Nestes ambientes as partículas absorvem a luz e constituem fontes de matéria orgânica permitindo que as bactérias associadas às partículas apresentam taxas de crescimento mais elevadas do que as que as vivem livremente (Kirchman & Mitchell 1982; Riemann et al. 2000; Cottrell et al. 2010). Apesar da importância das bactérias AAnP, na ecologia microbiana, pela sua contribuição no fluxo do carbono e da energia, a abundância e diversidade destas bactérias, assim como os fatores ambientais que controlam o seu crescimento estão pouco estudados. O objetivo deste trabalho foi investigar os padrões de variação espacial e temporal das bactérias AAnP em biofilmes MPB no estuário do Tejo. Foram realizadas amostragens em quatro estações do ano (Inverno, Primavera, Verão e Outono), em três tipos diferentes de sedimentos (areia, misto e vasa). Com este objetivo, foram perspetivadas duas abordagens diferentes e complementares: (i) técnicas dependentes de cultivo, que englobaram o isolamento de potenciais bactérias AAnP, a subsequente caracterização fenotípica e molecular dos isolados e a sua afiliação numa árvore filogenética, baseada nas sequências de fragmentos do gene pufM; (ii) técnicas moleculares, independentes de cultivo, que consistiram fundamentalmente em amplificação por PCR e eletroforese em gel com gradiente de temperatura (TGGE) do gene fotossintético pufM e fragmentos do gene 16SrRNA, para monitorização espacial e temporal das comunidades microbianas. Com a abordagem dependente de cultivo obtiveram-se 124 isolados, distribuídos, ao longo do tempo pelos diferentes sedimentos, correspondentes a, por 46 diferentes unidades operacionais de taxonomia (OTUs), que eram semelhantes a outras comunidades bacterianas de estuários e agrupadas em Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes e a isolados não classificados de solos e sedimentos (Crump et al. 1999, 2004). As amostras recolhidas eram particularmente ricas em Alpha e Gammaproteobacteria, onde se incluem as bactérias AAnP (Waidner & Kirchman 2007, Lami et al. 2009) e que estão frequentemente associadas a partículas (Crump et al. 1999, 2004, Giorgio & Bouvier 2002, Waidner & Kirchman 2008). Foi efetuada a caracterização fenotípica dos isolados (observação macroscópica das colónias, morfologia celular, coloração de Gram). Para a identificação de potenciais bactérias AAnP procedeu-se à amplificação do gene pufM no conjunto dos isolados. O gene pufM codifica para a subunidade M do centro de reação fotossintético, que está presente em todas as bactérias AAnP (Nagashima et al. 1997, Beja et al. 2002, Zheng et al. 2011). Do conjunto dos 124 isolados isolaram-se duas potenciais bactérias AAnP positivas para o gene pufM e com crescimento na presença de luz e oxigénio: SPS1025 (isolada na Primavera) e SPW1034 (isolada no Inverno). Estes dois isolados foram filiados respetivamente nos Géneros Rhodovulum e Shewanella, embora não sejam semelhantes a alguma das espécies descritas. Na continuidade deste trabalho foram aplicados outros critérios taxonómicos, permitindo num futuro breve propor a criação de duas novas espécies "Rhodovulum lusitanum sp. nov." e “Shewanella lusitana sp. nov.”. A abordagem molecular independente de cultivo baseou-se fundamentalmente na amplificação por PCR do DNA genómico das comunidades bacterianas presentes nos sedimentos utilizando como alvos os genes 16S rRNA e pufM. Observou-se amplificação do gene 16S rRNA em todas as amostras e, foi possível detetar bactérias AAnP nos diferentes tipos de sedimentos e ao longo de todo o ano. Este resultado confirma que este grupo funcional bacteriano deve constituir um componente relevante nos biofilmes MFB intertidais estuarinos. Apesar das bactérias AAnP colonizarem todos os sedimentos, a sua abundância e diversidade nos sedimentos arenosos foi maior quando comparada com os de vasa, o que indicia que o tipo de sedimento é uma variável importante na estrutura destas comunidades bacterianas nos biofilmes MFB, o que é concordante com outros trabalhos sobre a fração eucariótica dos biofimes MFB (e.g. Jesus et al., 2009; Ribeiro et al., 2013). Para avaliar a diversidade dos indivíduos da comunidade bacteriana total e de AAnP utilizou-se a técnica de TGGE, para cada um dos genes estudados. Esta técnica permite separar genes de iguais massas moleculares mas de diferente sequência nucleotídica (Muyser & Samlla 1998). De forma a analisar a diversidade das comunidades bacterianas totais e de bactérias AAnP foram calculados diferentes índices de diversidade, utilizando os perfis de TGGE. A análise da abundância e da diversidade das bactérias AAnP nos vários sedimentos durante um ano permitiu concluir que estes parâmetros apresentavam uma variação ao longo do ano, com uma maior abundância de bactérias AAnP mas menor diversidade no verão, e o inverso nas estações mais frias, resultados consistentes com os observados noutros ecossistemas (Jiao et al. 2007; Cottrell & Kircham 2009; Lehours et al. 2010 e Jeanthon et al. 2011). Na sua globalidade as comunidades bacterianas do estuário do tejo variaram em função das estações do ano (como noutros estuários em Fortunato et al. 2012) e, pelo contrário, os sedimentos não eram fatores determinantes no estabelecimento destas comunidades. Ainda assim, as bactérias AAnP, ao contrário do que se observou com as comunidades bacterianas totais, evidenciaram uma maior estabilidade ao longo do ano (como em Yutin et al. 2008). Nos dois casos o verão foi sempre a estação que apresentou uma maior dispersão espacial.engBiofilmesBactérias aeróbicasEstuário do Tejo - PortugalTeses de mestrado - 2013master thesis201281856