Ferreira, Fernando António da CostaMartins, Carlos Lopes VieiraFrouco, Gonçalo Daniel dos Santos2018-02-152018-02-152018-01-30Frouco, G.D.S. (2018). Modulating chromatin structure and gene expression during African swine fever virus infection : new strategies for an efficient vaccine rational design. Tese de Doutoramento. Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina Veterinária, Lisboa.http://hdl.handle.net/10400.5/14927Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, na especialidade de Sanidade Animal.African swine fever virus (ASFV) is a nucleo-cytoplasmic large DNA virus which infects all members of the family Suidae, causing a fatal disease of domestic swine and wild boar. Since no effective vaccine or treatment is available, ASF is considered a global threat for pig husbandry. The ASFV genome encodes among others, enzymes required for virion assembly, genome transcription and replication, including a putative histone-like protein, pA104R. In bacteria, these proteins perform topological modification of the chromosome (twisting, bending and folding), playing important structural and regulatory functions. Since ASFV has a large genome, a viral histone-like protein may be important for packaging its genome within the virion particle and/or for viral replication and transcriptional events. In this study, the ASFV-pA104R activity was characterized and its DNA-binding activities were evaluated. pA104R binds both to ssDNA and dsDNA, although having higher affinity to ds-DNA, over a wide range of temperatures, pH values, and salt concentrations and in an ATP-independent manner, with an estimated binding site size of about 14 to 16 nucleotides. The arginine residue located in pA104R’s DNA-binding domain, at position 69, also revealed to be important for an efficient DNA-binding. Additionally, since pA104R together with the viral type II topoisomerase, pP1192R, displayed DNA-supercoiling activity, a synergistic effect between these viral is proposed. The expression of pA104R was observed in the late phase of infection in infected cells with the Vero-adapted ASFV isolate Ba71V, co-localizing with cell nucleus and viral factories. siRNA experiments showed that the knockdown of A104R induce a reduction of viral progeny, copy numbers of viral genomes and transcription of a late viral gene, revealing that pA104R plays a critical role in viral DNA replication and gene expression. Results obtained on these studies prompted us to pursue the objective to generate a defective infectious single cycle (DISC) ASFV lacking the A104R gene. Recombinant virus was successfully obtained, however the complementary cell line previously developed did not support its replication. The antiviral activity of four HDACi against ASFV was also evaluated in this study. The results showing the abrogation of viral replication by NaPB open new insights on its use as an antiviral strategy to control ASFV spreading. Overall our data strongly support that pA104R plays an important role on ASFV replication opening a new window for the design of ASF control measures through the development of efficient and safe vaccines and antivirals.RESUMO - Modulação da estrutura cromatínica e da expressão génica durante a infeção do Vírus da Peste Suína Africana – novas estratégias para o desenvolvimento de uma vacina eficaz - O vírus da peste suína africana (VPSA) é um vírus de DNA nucleo-citoplasmático que infeta todos os membros da família Suidae, causando uma doença com elevada mortalidade em suínos domésticos e nos javalis. Atualmente não existe uma vacina ou tratamento eficaz, tornando a peste suína africana (PSA) uma ameaça para a suinicultura mundial. O genoma do VPSA codifica aproximadamente 150 proteínas, algumas delas bem caracterizadas, estando envolvidas na transcrição, replicação ou na montagem do virião. No entanto, e apesar de todos os esforços realizados nas últimas décadas, a função biológica de numerosas proteínas virais não é ainda conhecida. Esta lacuna aliada à necessidade de um melhor entendimento sobre a biologia do VPSA e as suas interações com o hospedeiro têm contribuído em grande parto para a dificuldade no desenvolvimento de uma vacina eficaz contra PSA. Por homologia de sequências proteicas, o genoma do VPSA codifica para uma proteína tipo histona (pA104R). Nas bactérias, estas proteínas são responsáveis por modular a topologia do DNA (torção, flexão e dobramento), desempenhando assim importantes funções estruturais e controlando a expressão de diferentes genes. O facto do genoma do VPSA codificar entre outras uma proteína viral semelhante a histonas bacterianas, reveste-se assim de enorme relevância pelo papel que que estas proteínas possam desempenhar na compactação do genoma na partícula viral e/ou para a sua replicação e transcrição. Neste contexto, este estudo pretendeu caracterizar o papel da VPSA-pA104R na replicação viral, tendo como objetivo contribuir para o conhecimento da biologia deste vírus e para averiguar se o gene A104R será um bom candidato para desenvolver uma vacina DISC (do inglês “defective infectious single cycle). Além disso, diferentes inibidores das histonas deacetilases (HDACs) foram testados como potenciais antivirais, eventualmente úteis no controlo da PSA Os principais objetivos deste trabalho foram assim os seguintes: (1) estudar VPSA-pA104R, através da clonagem, expressão, purificação e caracterização de sua atividade in vitro; (2) Compreender a relevância funcional de dois resíduos conservados de pA104R; (3) Avaliar os níveis de mRNA e proteína, bem como a localização intracelular de pA104R em células infetadas com VPSA, em diferentes tempos de infeção; (4) Desenvolver uma estratégia que permita a deleção da ORF A104R do genoma do VPSA e a obtenção de uma vacina DISC; (5) avaliar os níveis de acetilação das histonas das células infetadas para melhor compreensão do mecanismo de modulação dos mecanismos epigenéticos do hospedeiro pelo VPSA; (6) Avaliar o efeito dos inibidores das HDACs na infeção pelo VPSA. Neste estudo, a VPSA-pA104R foi expressa num sistema procariota baseado em Escherichia coli. Após a sua purificação, a sua atividade foi caracterizada através de ensaios EMSA (do inglês “electrophoretic mobility shift assay”) e concluiu-se que esta proteína viral se liga tanto a DNA de cadeia simples como dupla, embora tenha maior afinidade para o de cadeia dupla, e estimou-se que o local de ligação seja cerca de 14 a 16 nucleótidos. Esta ligação ao DNA continua presente em variadas condições de temperaturas, pH e concentrações de sal e é independente de ATP. A perda de atividade da proteína mutada pontualmente no resíduo de arginina localizado na posição 69, revelou que este resíduo é importante para uma ligação eficaz ao DNA. Além disto, foi possível concluir que a carga positiva deste aminoácido é determinante para a capacidade de ligação do pA104R ao DNA. Adicionalmente, uma vez que se observou atividade de superenrolamento de DNA quando a pA104R e uma topoisomerase tipo II viral, pP1192R, foram adicionados a DNA plasmídeo relaxado, este trabalho suporta que o VPSA codifica de facto para proteínas necessárias a compactação do seu genoma e ainda é proposto a existência de um efeito sinérgico entre as duas proteínas virais acima descritas. Como o objetivo de melhor compreender a importância da pA104R na infeção do VPSA, avaliou-se a dinâmica da sua expressão e a sua localização intracelular. A expressão de pA104R foi observada na fase tardia da infeção em células Vero infetadas com o isolado viral Ba71V, co-localizando com núcleo da célula e fábricas virais citoplasmáticas. Em relação à dinâmica de transcrição do gene A104R, apesar de ser típica de um gene tardio, foi possível detetar transcritos a partir das 2 horas pós-infeção (hpi). As experiências usando siRNA (do inglês “small interference RNA”) contra os transcritos do gene A104R, mostraram que a redução dos níveis de RNA deste gene induzem uma redução da progenia viral, do número de cópias de genomas virais e da transcrição de um gene viral tardio (B646L), revelando que o pA104R desempenha um papel crítico na replicação do DNA viral e na expressão de genes virais. Atualmente, as únicas medidas de controlo do VPSA são baseadas na deteção precoce da doença e na rápida aplicação de medidas biossanitárias como o abate de animais infetados, controlo do movimento de animais e a vigilância. As tentativas falhadas até agora em obter uma vacina inativada ou atenuada permitem que novas estratégias, como as vacinas DISC ganhem espaço na investigação do VPSA como uma revigorante estratégia para controlar o VPSA. Os resultados obtidos neste estudo, anteriormente descritos, suportam a ideia que um mutante de deleção no gene A104R replicará o seu genoma nas células hospedeiras, mas não poderá compacta-lo dentro do virião, resultando num virião não-infecioso "vazio" que será incapaz de iniciar um segundo ciclo de infeção. Assim a infeção com este vírus mutante será capaz de estimular o sistema imunitário do hospedeiro, mas ao mesmo tempo será seguro, não produzindo progenia infeciosa. Assim outro objetivo deste trabalho foi então obter um vírus DISC deletado no gene A104R. Para isto, o vírus recombinante foi obtido por recombinação homóloga e uma linha Vero complementar, que expressa a pA104R, foi desenvolvida. Embora, o vírus recombinante tenha sido obtido com sucesso, a linha celular complementar desenvolvida não suporta a sua replicação e, como tal, a seleção e propagação do vírus recombinante não foi possível. Os baixos níveis de expressão de pA104R destas células quando comparados com os de células infetadas poderão explicar esta não complementação. Com base em estudos anteriores que mostram que VPSA regula o estado epigenético da célula hospedeira, o grau de acetilação das histonas de células infetadas foi avaliado e a atividade antiviral de quatro inibidores das HDACs (NaPB, VPA, TSA e SAHA) contra a infeção pelo VPSA também foi testada neste estudo. O VPSA induz uma hipoacetilação dos resíduos de lisina 9 e 14 da histona H3 (H3K9K14). Esta modificação epigenética corrobora outras reportadas noutros estudos e todas elas estão classicamente correlacionada com o silenciamento de genes em células eucarióticas e pode indicar que o VPSA subverte diferentes mecanismos celulares, controlando o acesso da maquinaria de transcrição aos genes hospedeiros. Adicionalmente, um dos inibidores das HDACs testados, o NaPB, reverte este estado de hipoacetilação da histona e inibe a replicação do VPSA, interferindo com a expressão de gene virais tardios. Os resultados obtidos neste estudo sugerem fortemente que a pA104R participa da modulação da topologia do DNA viral, estando envolvida na replicação, transcrição e/ ou compactação do DNA viral. Com o objetivo de desenvolver uma vacina DISC, o gene A104R poderá assim constituir um bom alvo a deletar. Esta nova estratégia poderá ser uma alternativa às tentativas até agora falhadas de obter uma vacina contra a PSA. Contudo, antes de uma vacina DISC ser realidade, um esforço científico no desenvolvimento de uma linha celular complementar será imperativo. Os resultados obtidos sugerem ainda que as HDACs celulares estão envolvidas no estabelecimento de infeção pelo VPSA e revelaram que o NaPB pode ser usado como uma estratégia antiviral adicional para controlar a propagação de vírus nas áreas de surto.engAfrican swine fever virusASFVhistone-like protein pA104Rvaccinedefective infectious singe cycle viral particlesantiviralsVírus da peste suína africanaVPSAproteína tipo-histona pA104Rvacinaspartículas virais-defective infectious singe cycle-antiviraisdoctoral thesis101411880