Oliveira, Nuno Filipe da Rocha Guerreiro deRodrigues, Maria Gabriela Gomes de FigueiredoCarreira, Daniel Coelho2024-03-2120242023http://hdl.handle.net/10451/63668Tese de Mestrado, Biologia Humana e Ambiente, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO cancro do pulmão (CP) é uma preocupação de saúde global em constante crescimento, impulsionada por fatores como tabagismo, idade, género, localização geográfica e exposição ocupacional. É classificado como o cancro mais letal em todo o mundo, especialmente devido aos diagnósticos em estágios avançados. O tabagismo continua a ser a sua principal causa, sendo responsável por mais de 80% dos casos nos Estados Unidos. Estes fatores destacam a necessidade urgente de uma prevenção, deteção precoce e tratamento do CP. O CP consiste em duas categorias principais: cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) e cancro do pulmão de células pequenas (CPCP), sendo o CPCNP o mais prevalente. Os principais fatores de risco do CP envolvem fatores de estilo de vida como dieta e obesidade, fumo de tabaco, uso de cigarros eletrónicos e exposições ambientais a substâncias como o rádon, amianto e poluição do ar. A exposição ocupacional a várias substâncias químicas e metais aumenta o risco de CP. Cádmio (Cd), um metal pesado, apresenta riscos significativos para a saúde, incluindo o aumento do risco de desenvolver CP. A exposição ao Cd ocorre por inalação em ambientes de trabalho e consumo de alimentos contaminados. Os mecanismos tóxicos incluem lesões no DNA, stress oxidativo, inflamação, disfunção mitocondrial e interferência na reparação do DNA. O Cd é classificado como cancerígeno para o Homem, pertencendo ao Grupo 1 na classificação da Internacional Agency for Research on Cancer (IARC). Vários compostos têm mostrado ser promissores na mitigação da toxicidade geral e genotoxicidade induzida pelo Cd, embora seja importante que esta área de investigação seja reforçada. A astaxantina (ATX), um carotenoide, é um potente antioxidante produzido principalmente por microalgas e usada para conferir a coloração vermelha-rosa aos animais de aquacultura. Além do seu papel de corante, a ATX apresenta propriedades antioxidantes notáveis, consideradas potencialmente 100-500 vezes mais fortes do que a vitamina E. A ATX tem sido extensivamente estudada pelos seus potenciais benefícios para a saúde, incluindo efeitos promissores em várias doenças pulmonares. ATX exibe propriedades anticancerígenas potentes atribuídas à sua capacidade de combater o stress oxidativo, um fator comum no desenvolvimento do cancro. Neste contexto, a compreensão dos diversos aspetos do CP induzido pelo Cd e a avaliação do potencial da ATX na sua prevenção torna-se muito importante para a mitigação deste problema de saúde global. Este estudo concentra-se na investigação do impacto do Cd nas células pulmonares (H1975 e BEAS2B), com ênfase particular no seu papel no aumento da proliferação celular, alterações metabólicas, e aumento do stress oxidativo via espécies reativas de oxigénio (ROS). Além disso, o presente estudo visa examinar as capacidades migratórias das células H1975 sob exposição ao Cd e investigar se a ATX poderá contrariar os efeitos pró-migratórios induzidos pelo Cd. Os modelos celulares selecionados tentam mimetizar os efeitos do Cd tanto em tecido saudável como em tecido de cancro, fornecendo informações sobre o potencial papel protetor da ATX in vitro. A viabilidade celular foi avaliada em ambas as linhas celulares, recorrendo ao ensaio do cristal violeta (CV) e de redução de MTS após 72 horas de exposição ao Cd. Os resultados indicaram um decréscimo da viabilidade celular dependente da concentração de Cd. Foram testadas concentrações de Cd entre 0.5-140 µM nas células H1975 e 5-50 µM nas células BEAS-2B. Os valores de IC50 calculados foram de 105,6 µM para o ensaio de CV e 110,7 µM para o ensaio de MTS nas células H1975, e de 38,2 µM para o ensaio de CV e 45,2 µM para o ensaio de MTS nas células BEAS-2B. Estes resultados mostram que as células BEAS-2B são consideravelmente mais sensíveis à citotoxicidade induzida pelo Cd em comparação com as células H1975. Para avaliar a viabilidade celular da ATX, procedeu-se de igual modo em ambas as linhas celulares. A viabilidade manteve-se inalterada em todas as concentrações de ATX (1-20 µM) após 72 horas de encubação. Para avaliar o impacto do tratamento com ATX em células pulmonares não tumorais expostas a Cd, foi realizada uma co-incubação recorrendo às células BEAS-2B por um período de 72 horas. Os efeitos foram avaliados através do ensaio do CV. A ATX não levou a nenhuma alteração com significado estatístico da citotoxicidade induzida pelo Cd per se para todas as concentrações testadas. Sendo as metástases responsáveis por mais de 90% das mortes relacionadas com o CP, avaliou-se a capacidade migratória das células cancerosas. Após a identificação de concentrações não citotóxicas de Cd, através de uma incubação de 32 horas em meio de cultura com 2% FBS com diferentes concentrações de Cd, foi realizado o denominado ensaio da ferida. A exposição ao Cd levou a um aumento da migração celular com significado estatístico para todas as concentrações, exceto 5 µM. Após 20 horas, a migração celular aumentou em 18% (p < 0,05), 33% (p < 0,001) e 35% (p < 0,001) para concentrações de Cd de 0.5 µM, 1 µM e 10 µM, respetivamente. A avaliação às 24 horas exibiu uma tendência semelhante, com um aumento na migração de 17% (p < 0,05), 31% (p < 0,001) e 33% (p < 0,001) para as mesmas concentrações. Às 32 horas, a significância estatística foi mantida para concentrações de 1 µM e 10 µM, mostrando um aumento de 22% (p < 0,01) e 26% (p < 0,01) na migração celular, respetivamente, evidenciando o efeito pró-migratório do Cd nestas células. Para avaliar o perfil metabólico de ambas as linhas celulares foi realizada uma analise de metabolómica preliminar, avaliando, neste caso, o endometaboloma em células expostas ao Cd (1 μM -10 μM). Nesta primeira abordagem ao estudo global do metaboloma, que se encontra ainda a ser finalizado, recorrendo a outras metodologias analíticas e à análise do exometaboloma, não foi possível verificar alterações significativas no perfil metabólico nas concentrações testadas. Um dos mecanismos de toxicidade de Cd é a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e a presença de stress oxidativo após a exposição a este metal. Este fenómeno provoca lesões no DNA, peroxidação lipídica, desregulação dos mecanismos de defesas antioxidantes, assim como a ativação de vias de sinalização sensíveis ao stresse oxidativo. Ambas as linhas celulares foram expostas a concentrações crescentes de Cd (1 µM -10 µM). O nível de ROS aumentou de uma forma marcada em ambas as linhas celulares para a concentração de 10 µM. Nas células H1975 houve um aumento de ROS de cerca de 1.3 vezes (p < 0,001), e 7.3 vezes (p < 0,0001) para as concentrações de 5 µM e 10 µM respetivamente. Nas células BEAS-2B, a concentração de Cd de 10 µM aumentou os níveis de ROS em 6.7 vezes (p < 0,0001), não sendo significativos os aumentos observados com concentrações inferiores. Para avaliar os efeitos combinatórios da ATX (20 µM) em células expostas ao Cd (1 µM e 10 µM) em termos de migração celular, procedeu-se do mesmo modo descrito no ensaio de migração anteriormente mencionado. Verificou-se que nenhuma das combinações testadas de Cd ou ATX exibiu efeitos citotóxicos (ensaio do CV). De seguida avaliou-se a capacidade migratória através do ensaio da ferida. Os resultados obtidos sugerem que a ATX contraria de uma forma consistente o efeito induzido pelo Cd na migração celular coletiva. Após 20 horas, o Cd (1 µM) aumentou a migração celular em 16% (p < 0,01), enquanto na concentração de 10 µM aumentou a migração em 23% (p < 0,001) em comparação com o controlo. A combinação de ATX (20 µM) com Cd reverteu a capacidade de migração para níveis basais encontrados nas células controlo não tratadas. Resultados semelhantes foram observados às 24 horas. O Cd na concentração de 1 e 10 µM levou a um aumento da migração celular em 14% (p < 0,01) e 18% (p < 0,001), respetivamente. A combinação de ATX (20 µM) com Cd reverteu eficazmente a migração celular para os níveis das células controlo. Estes resultados indicam que a ATX tem capacidade de mitigar o efeito pró-migratório induzido pelo Cd, sendo este um achado muito importante da presente dissertação. Em resumo, este estudo investigou o impacto do Cd nas células pulmonares, com foco na viabilidade celular, geração de ROS, migração celular e metaboloma. O estudo revelou que o Cd induziu um aumento na migração celular das células H1975, indicando um potencial pró-migratório deste metal em células de CPCNP. Além disso, a exposição ao Cd resultou num aumento de produção significativa de ROS. Por seu lado, a ATX, contrariou eficazmente o efeito pró-migratório do Cd, restaurando para níveis basais a migração celular. Estes resultados destacam o potencial da ATX como uma potencial estratégia terapêutica para mitigar os efeitos adversos do Cd em células de CPCNP. Esta linha de investigação deverá ser mais aprofundada em estudos adicionais de modo a contribuir para uma compreensão mais aprofundada dos mecanismos subjacentes aos efeitos tóxicos do Cd nas células pulmonares e fornecer mais dados que suportem o papel benéfico da ATX.Cadmium (Cd) is a metal contaminant arising from natural and human activities. Human Cd exposure occurs through various channels namely occupational settings, contaminated food and water, and cigarette smoke. Cd is linked to lung cancer (LC), particularly non-small cell lung cancer (NSCLC), the most prevalent subtype. Recognized as a human carcinogen, comprehending the role of Cd in carcinogenesis and tumor progression is crucial. Astaxanthin (ATX) belongs to the family of xanthophylls classified as carotenoids. Besides its industrial use in aquaculture, ATX is a potent antioxidant used as a human dietary supplement. ATX exhibits promising results in preventing cancer, boosting immunity, and in other diseases like asthma, COPD, and lung fibrosis. This study investigates the effect of Cd (CdCl2), alone or in combination with ATX, in human NSCLC cells (H1975) and nonmalignant lung cells (BEAS-2B). This work also evaluates the impact of ATX in the mitigation of Cdinduced toxic effects. The endpoints selected encompass cell viability, migration, ROS levels, and metabolomics. Cytotoxic effects of Cd and ATX in H1975 cells and BEAS-2B cells were evaluated by crystal violet staining assay and the MTS reduction assay. The results showed that Cd is cytotoxic, albeit only at high concentrations, with greater impact on non-malignant cells, while ATX, revealed no cytotoxicity. Cd increased ROS production across both cell lines in a concentration-dependent manner. A preliminary metabolome analysis on both cell lines yielded no significant results. Non-cytotoxic concentrations of Cd and ATX were selected to perform the wound-healing assay in H1975 cells. Cd was able to increase the collective cell migration and co-incubation with ATX was able to revert the Cdinduced cancer cell migration. Overall, Cd exhibits cytotoxicity in lung cells, with differing sensitivity between non-malignant and malignant cells. Importantly, it promotes NSCLC cell migration, which is ameliorated by ATX and increases ROS production.engCancro do Pulmão de Células Não PequenasCélulas Epiteliais PulmonaresCádmioCitotoxicidadeAstaxantinaTeses de mestrado - 2024master thesis203881702