Pacheco, Rita Isabel DiasReis, Ana Catarina Beco PintoTeixeira, Laura Daniela Miranda2025-01-292025-01-2920252024http://hdl.handle.net/10400.5/97923Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO aumento da esperança média de vida tem como consequência uma população mais envelhecida, o que traz vários desafios, especialmente no que diz respeito à necessidade de manter a saúde e o bem-estar. Nomeadamente, o envelhecimento é um fator de risco para várias doenças, como as doenças cardiovasculares (CVDs). As CVDs são atualmente consideradas a primeira causa de morte mundialmente e, diversos fatores contribuem para o seu desenvolvimento, sendo a hipercolesterolemia um dos principais. Esta condição é caracterizada pela presença de elevados níveis de colesterol no sangue, o que pode favorecer o desenvolvimento de aterosclerose, aumentando assim o risco de eventos cardiovasculares. Deste modo, regular o valor de colesterol no sangue é essencial para diminuir o risco de CVDs. Esta regulação pode ser realizada a diferentes níveis, nomeadamente através da biossíntese endógena do colesterol no fígado, da absorção intestinal do colesterol proveniente da dieta e da sua circulação pelo organismo. Contudo, nem sempre é possível manter os níveis de colesterol dentro dos parâmetros recomendados e, quando estes se encontram elevados certas medidas são tomadas, como por exemplo o uso de fármacos ou suplementos juntamente com a adoção de um estilo de vida mais saudável. Os dois fármacos mais usados no tratamento da hipercolesterolemia são as estatinas e a ezetimiba. As estatinas são inibidoras da enzima reguladora da síntese endógena do colesterol, a 3- hidroxi-3-metillglutaril coenzima A redutase (HMGR). A ezetimiba é responsável por inibir a absorção do colesterol proveniente da dieta no intestino. Apesar destes fármacos serem frequentemente utilizados, existem efeitos secundários associados ao seu uso crónico, com relatos de indivíduos que apresentam problemas musculares e, consequentemente, alguns têm de descontinuar este tratamento. Assim sendo, a procura de alternativas a estes fármacos tem vindo a aumentar, em particular tratamentos com base em produtos naturais. Dentro destes, destacam-se os suplementos alimentares como estratégia complementar aos fármacos convencionais. O aumento da consciencialização sobre a saúde e o bemestar, aliado ao envelhecimento da população, contribui para o aumento da procura por suplementos que ajudem a controlar o colesterol e a promover a saúde cardiovascular. Os suplementos alimentares são utilizados para complementar a dieta, contribuindo para o tratamento e prevenção de doenças, assim como a promoção da saúde. Os suplementos alimentares podem ser uma fonte importante de compostos bioativos, alguns derivados de plantas, como os compostos fenólicos. Estes compostos são uma classe de metabolitos secundários, encontrado em várias partes das plantas. Os compostos fenólicos têm sido alvo de inúmeros estudos, pois apresentam várias propriedades benéficas, destacando-se pela sua elevada capacidade antioxidante que contribui para a proteção celular contra o stress oxidativo. Os suplementos alimentares para a saúde cardiovascular e o tratamento da hipercolesterolemia frequentemente incluem compostos fenólicos derivados de plantas, no entanto, a evidência científica sobre a eficácia e a segurança de alguns desses produtos ainda é limitada. APersea americana, conhecida como abacate, tem vindo a ganhar bastante popularidade devido aos seus efeitos benéficos para a saúde. O aumento da procura por este fruto é acompanhado por um crescimento da sua indústria. Contudo, esta indústria gera um grande volume de resíduos, uma vez que as cascas e as sementes deste fruto são frequentemente descartadas. Por outro lado, estudos relataram que extratos obtidos à base de cascas e/ou sementes de abacates demonstraram altos teores de compostos fenólicos e atividade antioxidante (AA), além de um grande potencial para diminuir os teores do colesterol no sangue. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo estudar um extrato feito com base na P. americana do tipo Hass e desenvolver um sistema de veiculação desse extrato em nanopartículas (NPs) de albumina de soro bovino (BSA) e avaliar o seu potential para a incorporação num suplemento alimentar. A utilização de NPs apresenta várias vantagens, como a capacidade de proteger o extrato de ambientes mais agressivos, como o trato gastrointestinal, além de serem biocompatíveis e biodegradáveis no organismo humano. O extrato e as formulações de NPs foram caracterizadas e avaliadas quanto à sua segurança e à sua capacidade de interferir na absorção do colesterol no trato gastrointestinal. Inicialmente, o extrato foi caracterizado através de cromatografia líquida acoplada a espetrometria de massa em tandem de alta resolução (UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS), onde foram identificados diversos compostos, incluindo compostos bioativos, como ácidos fenólicos, flavonoides e taninos. Seguidamente, o extrato foi analisado por cromatografia líquida de alta eficiência com detetor de diodo-array (HPLC-DAD), para a quantificação de três compostos fenólicos, nomeadamente o ácido clorogénico, a catequina e a epicatequina. A quantificação do conteúdo em fenóis totais foi também realizada, confirmando-se um elevado teor destes compostos no extrato. Posteriormente, foi avaliada a AA do extrato, que demonstrou apresentar uma elevada atividade e, adicionalmente, conseguiu reduzir o stress oxidativo induzido numa linha celular humana do fígado (HepG2). Em ensaios de segurança in vitro em duas linhas celulares, uma do intestino (Caco-2) e outra do fígado (HepG2), assim como ensaios in vivo em Artemia salina, foi avaliada a segurança do extrato. Em todos os casos o extrato revelou baixas taxas de mortalidade e portanto, foi classificado como não sendo tóxico, podendo potencialmente ser usado para consumo humano. De modo a simular o consumo humano, o extrato foi submetido a uma simulação da digestão gástrica, onde se verificou que este foi degradado, tendo-se confirmado por HPLC-DAD que a quantidade dos seus compostos constituintes e a sua AA diminuíram. De forma a avaliar a capacidade do extrato interferir na permeabilidade do colesterol, foram realizados ensaios de permeabilidade da barreira gastrointestinal num modelo celular dos enterócitos (Caco-2). Neste modelo de células do intestino, verificou-se que o extrato foi capaz de reduzir a permeabilidade do colesterol e este foi capaz de permear a barreira gastrointestinal. Com base nos resultados anteriores, o extrato foi encapsulado em NPs de BSA. As NPs de BSA foram formuladas contendo diferentes quantidades de extrato e caracterizadas por dispersão dinâmica de luz (DLS) e microscopia de força atómica (AFM). Por DLS foi possível concluir que todas as NPs de BSA preparadas apresentavam um tamanho médio inferior a 410 nm, um índice de polidispersão inferior a 0,2 e uma carga superficial negativa. A partir das imagens das NPs de BSA obtidas por AFM, verificou-se que as NPs apresentavam uma forma esférica. A eficiência de encapsulação dos compostos bioativos nas NPs de BSA preparadas foi determinada como sendo superior a 80 %. Nos ensaios preliminares de estabilidade realizados, as NPs de BSA preparadas não apresentaram alterações significativas nos valores do tamanho médio e do índice de polidispersão ao longo do tempo, demostrando a sua estabilidade. Relativamente ao extrato livre, as NPs de BSA com extrato encapsulado revelaram ter menor AA, o que demostra que o extrato está encapsulado e não acessível para os seus compostos bioativos reduzirem o radical DPPH durante o ensaio. As NPs de BSA foram também sujeitas a ensaios de segurança in vitro contra as linhas celulares Caco-2 e HepG2, e in vivo na A. Salina, confirmando em ambos os casos a segurança das nanoformulações preparadas. Seguidamente, quando as NPs de BSA foram submetidas a uma digestão gástrica verificou-se que o extrato não foi degradado em comparação com o extrato livre. Por último, nos ensaios de interferência das NPs de BSA sobre a permeabilidade do colesterol em modelos das células Caco-2, verificou-se que as nanoformulações apresentaram uma redução maior que a do extrato isolado. Verificou-se adicionalmente que a capacidade do extrato encapsulado nas NPs de BSA de permear a barreira gastrointestinal foi inferior à do extrato livre. Em suma, os resultados deste trabalho demonstraram que o extrato de abacate e as NPs de BSA com extrato encapsulado, apresentam potencial para serem utilizados no desenvolvimento de um suplemento alimentar para a saúde, em particular na prevenção e tratamento da hipercolesterolemia e CVDs. A encapsulação do extrato demonstrou ser uma vantagem, uma vez que no geral aumentou a sua estabilidade, eficácia no tratamento e prevenção da hipercolesterolemia e protegeu os seus compostos bioativos durante a digestão gástrica. Em estudos futuros, poder-se-ão investigar as interações do extrato e das NPs de BSA com proteínas de transporte do colesterol, assim como a interação entre os compostos do extrato com os enterócitos. Adicionalmente, a capacidade do extrato de inibir enzimas da via da biossíntese do colesterol endógeno que ocorre no fígado poderá ser avaliada, uma vez que os seus compostos bioativos permeiam a barreira gastrointestinal. Este estudo traz resultados inovadores ao desenvolver uma solução sustentável para a saúde cardiovascular, utilizando um extrato derivado do abacate encapsulado em NPs de BSA, alinhando-se aos Objetivos de Desenvolvimento Sustentável. Além disso, a encapsulação de compostos bioativos em NPs de BSA é uma tecnologia inovadora que oferece uma nova perspetiva no tratamento da hipercolesterolemia. Esta solução tecnológica enquadra-se no nível 3 do Nível de Maturidade Tecnológica, uma vez que os conceitos científicos básicos foram estabelecidos e os primeiros passos na avaliação da sua aplicação prática foram realizados.Ensuring health and well-being of individuals is extremely important, especially for the elder population. Hypercholesterolemia, characterized by high levels of blood cholesterol, is a risk factor of cardiovascular diseases (CVDs). Current drug treatments available for this condition have several adverse side effects. Therefore, the research and market for alternatives based on natural products has been increasing. The aim of this work was to study an extract derived from Persea americana. The extract was characterized by high resolution mass spectrometry (UHPLC-ESI-QTOF-MS/MS) and highperformance liquid chromatography (HPLC-DAD). Several bioactive compounds were identified and, chlorogenic acid, catechin and epicatechin were quantified. A delivery system for the extract was selected and developed using bovine serum albumin (BSA) nanoparticles (NPs). The extract-loaded BSA NPs displayed a spherical shape, a mean size below 410 nm and an encapsulation efficiency greater than 80 %. The extract exhibited a strong antioxidant activity, however, this activity reduced after encapsulation. Additionally, the extract was able to protect liver cells from induced oxidative stress. The safety of the extract and extract-loaded BSA NPs was confirmed in both in vitro and in vivo models. Furthermore, in a Caco-2 cell model, the free extract reduced cholesterol’s permeability, with an effect more pronounced after encapsulation. The encapsulation also protected the extract from degradation during gastric digestion, a challenge observed in the free extract. In conclusion, the extract showed promising properties, with encapsulation enhancing its stability and effectiveness against hypercholesterolemia. The BSA NPs were able to protect the extract from the harsh environment of the gastric tract and boosted its potential to serve as a food supplement, a possible strategy to manage hypercholesterolemia and reduce the risk of CVDs.engAbacateProdutos naturaisNanopartículasDoenças CardiovascularesColesterolTeses de mestrado - 2025master thesis