Bourbon, MafaldaLacerda, RafaelaMateus, Ana Margarida Ramos2024-12-0220242024http://hdl.handle.net/10400.5/95867Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA proproteina convertase subtilina/kexina (PCSK9) é uma serina protease expressa principalmente no fígado e codificada pelo gene PCSK9, localizado no braço curto do cromossoma 1 (1p32.3). Este gene é constituído por 11 intrões e 12 exões, resultando numa sequência com 22kb. A subunidade catalítica da PCSK9 liga-se ao complexo formado entre as lipoproteínas de baixa densidade (c-LDL) e o receptor das mesmas (LDLr), formando um novo complexo que é endocitado e encaminhado para a degradação lisossomal na célula. A degradação deste complexo impede que os LDLr sejam reciclados e voltem à superfície celular, diminuindo a remoção de LDL e, consequentemente, aumentando a sua concentração na circulação sanguínea. A existência de variantes hereditárias no gene PCSK9 podem levar a dois fenótipos distintos; se as variantes forem de ganho de função, levará a um fenótipo de hipercolesterolemia já que existe degradação exacerbada de LDLr, resultando num aumento da concentração de c-LDL em circulação. Esta hipercolesterolemia se não for tratada o mais cedo possível, está associada a um risco elevado de doença cardiovascular, com ocorrência de aterosclerose prematura nestes indivíduos. A perda de função da PCSK9 leva a uma diminuição da concentração de c-LDL, levando a casos de hipocolesterolemia, associados com um baixo risco de doença cardiovascular. A descoberta deste gene em 2003 e a sua correlação com a homeostase do colesterol, abriu a porta para um novo alvo terapêutico na regulação do metabolismo lípidico. Quando os níveis intracelulares de esteróis estão diminuídos, o PCSK9 é positivamente regulado por dois fatores de transcrição: a proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 2 (SREBP2) e o fator nuclear hepático 1α (HFN1α), enquanto que a transcrição do LDLR é apenas regulada pelo SREBP2. As estatinas são o tratamento de primeira linha em indivídios com hipercolesterolemia, já que induzem a expressão de SREBP2, regulando positivamente a transcrição de LDLR, aumentando a captação de LDL e diminuindo a sua concentração em circulação. Contudo, a transcrição do PCSK9 também é ativada, e a trancrição de LDLR não consegue compensar este efeito, diminuindo os efeitos benéficos em alguns indivíduos. Um dos grandes desafios é compreender a regulação fisiológica da expressão do PCSK9 aos níveis transcricional e pós-transcricional. Em 2020, 17 variantes encontradas na ClinVar e na literatura, foram compiladas e descritas consoante a sua localização na região do promotor ou na 5’UTR do PCSK9. Deste modo, destas 17 variantes, 3 estão na região do promotor, enquanto as restantes 14 encontram-se na 5’UTR, mas todas localizadas 650 pares de bases (pb) a montante da região codificante do PCSK9. A ClinVar é uma base de dados pública que categoriza as variantes genéticas pela sua interpretação clínica para as mais diversas doenças mendelianas, sumarizando a sua informação clínica proveniente de outras bases de dados, facilitando a sua compreensão. Das 17 variantes compiladas, 16 estão submetidas na ClinVar, onde 11 apresentam classificação de “significado clínico incerto” (VUS), existindo a necessidade da realização de estudos funcionais para se poder chegar a uma classificação definitiva para o diagnóstico correto dos indíviduos que tenham estas alterações genéticas. O diagnóstico correto começa pela interpretação correta das variantes por laboratórios certificados sendo estas variantes classificadas como “patogénicas” ou “benignas”. Com a recente introdução de técnicas que permitam sequenciação paralela em massa, como é o caso da sequenciação de nova geração (NGS), mais e novas variantes são identificadas a partir de uma só análise. Desde a descoberta do gene PCSK9, já foram submetidas 985 variantes na base de dados Clinvar, maioritariamente identificadas em indíviduos hipercolesterolémicos. Baseado nesta lacuna na compreensão dos mecanismos subjacentes à regulação da expressão do PCSK9, três variantes na região do promotor do PCSK9, próximas do elemento regulador de esterol (SRE), foram estudadas. Com este objetivo, o promotor e a região 5’ não traduzida (5’UTR) do gene PCSK9 (do nucleótido -650 ao -1) foram clonados no plasmídeo pGL4.10[luc2], contendo a região codificante do gene repórter Firefly luciferase (FLuc). Após efetuar mutagénese dirigida para obter as variantes em estudo, os plasmídeos foram transfetados para dois tipos de células imortalizadas de hepatoma: HepG2 e Huh7. Para a transfeção, 0.75x105 e 1.5x105 de Huh7 e HepG2, respetivamente, foram plaqueadas em poços de 35mm num volume final de 2 mL de meio adequado suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS). A transfeção foi feita imediatamente após o plaqueamento das células com 1500 ng de DNA plasmídico e 500 ng de Renilla Firefly (Rluc). Após 24h de incubação, o meio das células foi alterado para meio adequado ao respetivo tipo celular com apenas 0.1% de FBS, de modo a mimetizar o jejum lípidico nas células. Após 12h a 18h de jejum, as células foram tratadas com 0.1% de dimetilsulfóxido (DMSO), o veículo para o fármaco, ou 10 µg/mL de mevastatina. Após 24h de incubação com a estatina ou o veículo, as células foram lisadas e a atividade da luciferase foi determinada usando um ensaio de gene repórter com luciferase dupla. As 3 variantes na região do promotor, próximas do SRE (c.-337), nomeadamente c.-353G>T, c.- 346G>C e c.-331C>A foram estudadas através dos ensaios de bioluminescência. Como era expectável, em ambas as linhas celulares (HepG2 e Huh7), o tratamento com a mevastatina aumentou a atividade do promotor em todos os plasmídeos com as diferentes variantes. Os resultados para as variantes c.-353G>T e c.-346G>C mostraram um comportamento consistente em ambas as linhas celulares. A variante c.-346G>C diminuiu a atividade do promotor para 26% ou 30% enquanto que a variante c.-353G>T aumentou a atividade para 48% ou 78% em HepG2 e Huh7, respetivamente, quando comparado ao wild-type. Estes resultados podem ser indicativos que a variante c.-346G>C pode estar associada a um fenótipo de hipocolesterolemia enquanto que a variante c.-353G>T pode estar associada a hipercolesterolemia. Enquanto que estas duas variantes mostram associação clara com fenótipos de hiper- ou hipocolesterolemia, a variante c.-331C>A, exibiu um comportamento mais complexo entre as duas linhas celulares, sendo necessário nova investigação. Contudo, em HepG2 houve um aumento da atividade do promotor em relação ao wild-type, que corrabora um outro estudo anterior baseado num sistema repórter e ativação do promotor com uma estatina. A expressão exacerbada do PCSK9 é um dos mecanismos subjacentes no tratamento com estatinas em indivíduos com hipercolesterolemia, consequentemente, levando a uma redução na eficiência deste fármaco. Variantes genéticas que afetam a regulação do PCSK9 através da atividade do promotor podem ser responsáveis pelas diferentes respostas interindividuais na terapia com estatinas. Assim, com base nos resultados obtidos, é possível concluir que indivíduos com a variante c.-346G>C terão uma melhor resposta ao tratamento com estatinas, enquanto que indivíduos com a variante c.- 353C>G vão ter uma pior resposta ao tratamento com estatinas, uma vez que vão ter níveis mais elevados de PCSK9 em circulação. Na última década, a introdução de novos fármacos dirigidos à PCSK9 como alvo terapêutico, como é o caso dos anticorpos monoclonais, possibilitou uma redução de c-LDL em indíviduos com fenótipo de hipercolesterolemia que, até então, seria impossível com só com as estatinas. Ao expandir o nosso conhecimento sobre como estas variantes afetam a síntese da PCSK9, através da ativação dos fatores de transcrição, aumentamos a caracterização de variantes e mecanismos que causam hipercolesterolemia. Esta caracterização também permite que os indivíduos que tenham estas variantes possam vir a receber terapia personalizada, dirigida à via metabólica afetada, alcançando um melhor prognóstico a longo prazo.Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a serine protease that binds to the lowdensity lipoprotein receptor (LDLr), targeting it to lysosomal degradation, limiting LDL clearance. In 2003, after the discovery of variants in the PCSK9 gene in dyslipidemic subjects, revealed it to be a major modulating gene in cholesterol homeostasis. When intracellular levels of sterols decrease, PCSK9 is positively regulated by Sterol Regulatory Element-Binding Proteins 2 (SREBP2) and Hepatic Nuclear Factor 1α (HFN1α), while LDLR transcription is only regulated by SREBP2. Statins induce the expression of SREBP2, which activates PCSK9 transcription, and LDLR transcription cannot compensate for this effect, diminishing the beneficial effects in some patients. The current challenge is to understand the physiological regulation of PCSK9 expression at the transcriptional and post-transcriptional level. Based on the lack of understanding of mechanisms behind the regulation of PCSK9 expression, 3 variants in the PCSK9 promoter region, close to the SRE motif were studied. To this purpose, the promoter and 5’ untranslated region (5’UTR) of PCSK9 (-650 to -1) were cloned into pGL4.10[luc2] plasmid containing the Firefly luciferase (FLuc) reporter gene. After site directed mutagenesis to obtain the variants in the study, they were transfected in HepG2 and Huh7 cell lines, and luciferase activity was determined by a Dual-Luciferase Reporter Assay System. Cells were starved with medium supplemented with 0.1% FBS, followed by treatment with mevastatin, activating transcription. Variant c.-346G>C showed a decrease in promoter activity of the wild-type, while variant c.-353G>T showed an increase compared to the wild-type. These results show that c.-353G>T can possibly lead to a familial hypercholesterolemia phenotype, while c.-346G>C can result in a hypocholesterolemia phenotype. Expanding our understanding of how these variants affect PCSK9 synthesis through the activation of transcription factors could lead to an opportunity for personalized therapy in subjects carrying these variants.engPCSK9Dislipidemia familiarAtividade do promotorVariantesTeses de mestrado - 2024master thesis203880110