Jacinto António Alfredo Coelho 1972-Simões, Mariana Guedes, 1980-2013-08-082013-08-082013http://hdl.handle.net/10451/8977Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013O processo regenerativo é um importante e apaixonante tema que tem ganho atenção crescente entre a Comunidade Científica nas últimas décadas. Ao contrário dos Humanos, que possuem uma fraca capacidade de regeneração, outros vertebrados, como os peixes teleósteos são capazes de regenerar órgãos e membros, incluindo as barbatanas. Embora este tema seja estudada há muito tempo, alguns dos seus processos cruciais permanecem por esclarecer. O peixe zebra (Danio rerio), um teleósteo que apresenta uma extraordinária capacidade de regenerar inúmeros órgãos e membros, tem sido usado repetidamente como modelo de estudo de Regeneração Epimórfica em organismos adultos. As barbatanas deste peixe apresentam uma capacidade de regeneração rápida e imediata após lesão e/ou amputação, através de um processo que envolve a coordenação de diversos mecanismos que incluem migração, desdiferenciação, proliferação e padronização, de forma a recuperar a forma, estrutura e função dos membros danificados. Imediatamente após amputação, as células epiteliais que circundam a ferida migram para cobrir e fechar a mesma, formando uma epiderme da ferida. Ao longo do tempo esta epiderme adquire novas camadas de células devido à contínua migração de células epiteliais, dando origem a uma estrutura complexa, chamada “Apical Epithelial Cap” (AEC). De seguida, o tecido mesenquimatoso por baixo da AEC perde a sua organização e as células desdiferenciam e migram no sentido do plano de amputação. Subsequentemente, estas células reentram no ciclo celular e acumulam-se para formar uma massa de células mesenquimatosas indiferenciadas e com elevado potencial proliferativo, ao qual se dá o nome de blastema e a partir da qual o tecido danificado ou perdido será reabilitado. Dentro dos 10 a 15 dias seguintes, as interacções estabelecidas entre a AEC e o blastema asseguram o crescimento da barbatana e durante este período todos os tipos celulares serão restabelecidos e uma nova barbatana formar-se-á. O estabelecimento e crescimento do blastema é um passo crucial para a reparação dos tecidos e a sua formação encontra-se sob o controlo de diferentes factores, incluindo a presença de nervos na estrutura a regenerar. Diversos estudos realizados em anfíbios e no teleósteo Fundulus demonstraram claramente que após a remoção da inervação das patas e barbatanas, a re-inervação das mesmas não acontece levando a uma falha no processo de regeneração. Tem sido sugerido que os nervos libertam factores nos membros amputados que promovem e sustentam a proliferação das células do blastema, e/ou alternativamente alcançam a AEC que subsequentemente envia sinais para o mesênquima, induzindo a desdiferenciação das células, um passo crucial para a reparação do tecido. Embora alguns factores tenham sido implicados na mediação da dependência da regeneração em relação aos nervos, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos neste processo ainda não são completamente compreendidos. Ao longo de vários anos os anfíbios foram eleitos como organismos de excepção para o estudo da regeneração em vertebrados devido à sua elevada capacidade regenerativa. No entanto, a inexistência de abordagens moleculares e genéticas eficientes para estudar estes organismos têm impedido o rastreio sistemático de genes necessários durante o processo de regeneração, pelo que alguns dos mecanismos moleculares subjacentes se mantêm pouco definidos. O objectivo deste projecto é assim clarificar o processo de dependência dos nervos durante a regeneração dos membros de vertebrados e investigar o papel de moléculas candidatas envolvidas neste processo, usando o peixe zebra como modelo de estudo. A investigação usando este organismo tem-se intensificado nos últimos anos devido às inúmeras vantagens experimentais que apresenta e que incluem: uma morfologia simples das barbatanas; um processo de regeneração rápido e credível; um acesso fácil a cirurgia e, acima de tudo, a possibilidade de manipulação molecular e genética. Por forma a determinar se o peixe zebra depende da inervação para regeneração das barbatanas, desenvolveu-se um protocolo de desnervação da barbatana peitoral, seguido de amputação, analisando o respectivo processo regenerativo. O protocolo estabelecido envolve a ablação dos nervos da barbatana peitoral na zona do plexus braquial, eliminando a inervação no interior dos raios e no tecido conjutivo entre raios. Este protocolo permitiu, pela primeira vez, estudar a dependência dos nervos durante a regeneração da barbatana em peixe zebra. Os resultados obtidos demonstram que uma correcta inervação da barbatana peitoral é essencial para o sucesso da regeneração. Após amputação, na ausência de nervos, ocorreu cicatrização da ferida, no entanto o estabelecimento de uma epiderme engrossada e especializada (AEC) com os correctos níveis de sinalização molecular não se concretizou. Estes resultados sugerem que a presença dos nervos no local de amputação são requeridos logo após cicatrização. Após cicatrização da barbatana, na total ausência de nervos, as barbatanas não estabeleceram um blastema, sendo incapazes de regenerar, enquanto que na presença de algumas fibras nervosas, formou-se um pequeno blastema e a regeneração progrediu. No segundo caso, as barbatanas regeneraram de forma anormal dando originem a barbatanas pequenas e deficientes. De acordo com o previamente descrito em anfíbios, após cicatrização as células mesênquimatosas das barbatanas desnervadas desorganizaram-se apresentando marcadores de blastema, no entanto, não proliferaram, não regenerando. O fenótipo mais relevante e inesperado associado à ausência de nervos durante a regeneração foi a deposição de osso ectópico entre a AEC e o mesênquima, originando um engrossamento da parte distal dos raios da barbatana. A observação da dinâmica dos osteoblastos utilizando os transgénicos Tg(Osteocalcin:GFP) e Tg (Osterix:mCherry) em barbatanas desnervadas, sugere que células de osso diferenciado que aparentemente migraram do osso antigo para o plano de amputação permaneceram lá sem se desdiferenciarem e integrarem o blastema. Apoiando esta ideia está a evidência de que genes envolvidos no alinhamento dos novos osteoblastos, como shh e ptc1 estão regulados negativamente, precisamente na altura em que a acumulação de células de osso se tornou evidente. Estas descobertas são consistentes com o reconhecido papel de shh no alinhamento de osteoblastos. O papel do nAG (newt anterior gradient protein), uma proteína excretada que se mostrou capaz de recuperar um blastema onde a inervação foi interrompida e induzir regeneração numa pata de salamandra , foi estudada neste sistema. Curiosamente, esta proteína não parece ter o mesmo papel durante a regeneração da barbatana do peixe zebra que tem durante a regeneração da pata da salamandra. Os homólogos de nAG (agr2; agr0) estão expressos apenas na epiderme e ausentes nos nervos da barbatana. Além do mais, após amputação da barbatana estes genes mantiveram-se expressos na epiderme, tanto nas barbatanas controlo como nas barbatanas sem nervo. Este resultado sugere que a origem evolutiva da regeneração terá tido uma base múltipla e independente De forma a compreender os mecanismos moleculares subjacentes à dependência dos nervos, foi realizado um “Microarray” para comparar barbatanas controlo e barbatanas desnervadas. Foram analisados aproximadamente 15.000 transcritos de peixe zebra, identificando-se 1.535 diferenciadamente expressos entre barbatanas controlo e desnervadas. Alguns destes genes já haviam sido implicados no processo de regeneração das barbatanas e já era expectável que a sua expressão fosse alterada nas barbatanas sem nervo, no entanto, a maioria representa novos genes potenciais nunca antes implicados na regeneração da barbatana. Uma análise bioinformática permitiu avaliar quais as funções celulares e vias de sinalização activadas ou inibidas nas barbatanas sem nervo. Esta análise permitiu reunir uma base de dados abrangente das vias moleculares envolvidas durante a regeneração e homeostasia na ausência de nervos, que servirão como uma importante ferramenta que permitirá descrever em maior detalhe a dinâmica da dependência dos nervos e investigar o papel de putativos factores mitogénicos e seus alvos moleculares. De modo a investigar o impacto da ausência de nervos na integridade e funcionamento dos vasos, utilizou-se o transgénico Tg(fli1a:EGFP), que expressa uma proteína verde fluorescente (GFP) nas células endoteliais, comparando barbatanas controlo e desnervadas. A diferença mais evidente foi a ausência de angiogénese nas barbatanas sem nervo. A integridade dos vasos não foi, aparentemente, afectada. Ao nível molecular, apenas dois receptores (robo1 e robo4) da família das proteínas “Slit” que participam na orientação espacial de neurónios e que regulam o desenvolvimento vascular, encontravam-se subexpressas. Tendo em conta estes resultados, a necessidade de nervos durante a regeneração da barbatana do peixe zebra aparentemente não actua via interacção com o sistema vascular, tal como anteriormente sugerido. No entanto, para verificação desta hipótese serão necessários estudos adicionais, uma vez que outras interacções que influenciem o funcionamento dos vasos poderão existir. Para investigar mais aprofundadamente a questão da dependência dos nervos durante a regeneração, foi estudado o barbilho maxilar do peixe zebra, de forma a estabelecer esta estrutura como um novo modelo in vivo útil para a compreensão deste processo. Embora não tenha sido possível desenvolver um protocolo de ablação de nervo neste modelo, importantes metodologias inovadoras foram conseguidas. A caracterização da morfologia de barbilhos intactos e amputados revelaram aspectos detalhados desta estrutura nunca anteriormente descritos. Foram desenvolvidos protocolos de hibridação in situ e de marcação com “Alcian Blue” que funcionam em peixe zebra e demonstrou-se que a injecção, seguida de electroporação é um método fiável para futuros estudos funcionais nesta estrutura. No seu todo, este trabalho apresenta o peixe zebra como um modelo conveniente e fiável para futuras investigações dos mecanismos moleculares e celulares responsáveis pela dependência dos nervos durante a regeneração de tecidos. Compreender a função dos nervos será crucial para delinear estratégias de forma a induzir regeneração em humanos. Este trabalho poderá contribuir para abrir novas perspectivas para aplicações em investigação biomédica na reparação de tecidos.Regeneration is an important and fascinante biological process, which has gain increasing attention among the scientific community for the last years. Unlike Humans, who display poor regenerative ability, other vertebrates, such as teleost fish, are able to regenerate several organs and body structures, including their fins. Although regeneration has been studied for years, some crucial steps of this process remain unclear. Zebrafish (Danio rerio), a teleost that presents an extraordinary capacity to regenerate several organs and appendages has been widely used as a model system to study “epimorphic regeneration” in adult organisms. Zebrafish fins are able to regenerate promptly after damage, through a process that involves the coordination of diverse cellular mechanisms including migration, dedifferentiation, proliferation and patterning to restore the shape, structure and function of the missing parts. Shortly after fin amputation, epithelial cells surrounding the wound migrate to cover and close the stump establishing a wound epidermis (WE). Over time the WE acquires additional layers by continuous cell migration, giving rise to a specialized epidermis called Apical Epithelial Cap (AEC). Then, the mesenchymal tissue beneath this cap loses its normal organization and cells dedifferentiate and migrate distally towards the amputation plane. Subsequently, these cells re-enter the cell cycle and accumulate to form the blastema, a highly proliferative mass of undifferentiated mesenchymal cells from which the missing parts of the fin will be rebuilt. Within the next 10 to15 days the interactions established between the AEC and the blastema ensure the outgrowth of the regenerating fin, and during this period all cell types are re-patterned and a new fin is then formed. The establishment and outgrowth of the blastema is a crucial step for tissue repair, and its formation is under the control of different factors, including the presence of nerves at the site of injury. Several studies performed in amphibian urodeles and in the teleost Fundulus have clearly shown that upon nerve fibre removal re-innervation of the stump is prevented and limb/fin regeneration is impaired. It has been proposed that nerves release factors into the amputated limbs/fins, which promote and sustain the proliferation of blastemal cells. Alternatively, the release factors may target the AEC, which then signals to the underlying mesenchyme to induce cell dedifferentiation, a crucial step for tissue repair. Although some factors have been implicated in mediating nerve-dependent regeneration, the cellular and molecular mechanisms involved in this process are not fully understood. For many years amphibians have been the organisms of choice for studying vertebrate regeneration for their ability to regrow multiple organs. However, a lack of well developed molecular and genetic approaches in these organisms have prevented systematic screening for genes required during the regeneration process, for this reason some of the underlying molecular mechanisms remain unclear. The aim of this project is thus to clarify the process of nerve dependence during vertebrate appendage regeneration and to investigate the role of candidate molecules involved in such process, using the zebrafish as a model system. Research using this model organism has intensified in recent years due to several experimental advantages, which include fin simple morphology, rapid and reliable regeneration process, easy accessibility to surgery and, above all, amenability to molecular and genetic manipulation. In order to determine whether zebrafish fin regeneration is dependent on a nerve supply, a protocol for pectoral fin denervation followed by amputation was developed, and the respective regenerative process analysed. The protocol for pectoral fin denervation involved the ablation of fin nerves by local surgery, in the region of the brachial plexus, leading to the elimination of fin innervation in the intra and inter-ray regions. This protocol allowed, for the first time, the use of zebrafish to study regeneration nerve dependency. The obtained results demonstrate that a proper innervation of the pectoral fin is essential for a successful regenerative process. Following amputation, in the absence of innervation, fins were able to close the wound and establish a WE within the first hours. However, thickening of the WE and consequent formation of the AEC was severally affected by denervation, as well as the signalling in this tissue and in its BEL. These results suggest that the presence of nerve fibres in the site of injury is required immediately after the closure of the wound. After wound closure, in the complete absence of nerve fibres in the stump, denervated rays were not able to establish a blastema and regeneration was totally impaired, while in the presence of a reduced amount of nerves in the stump, a small blastema was still formed and regeneration proceeded. In the second case fins exhibited limited and defective regeneration, giving rise to smaller and abnormal fins with reduced inter-ray tissue. In agreement to what has been described in amphibians mesenchymal cells lying under the WE of denervated fins became disorganized as the controls, but then failed to form a proliferative blastema and regenerate. The most striking phenotype associated with denervation was the ectopic deposition of bone at 4 dpa, between the BEL and the mesenchyme leading to distal fin thickening. The observation of scleroblast’s dynamics using the zebrafish transgenic lines Tg(Osteocalcin:GFP) and Tg (Osterix:mCherry) in denervated fins suggests that bone differentiated cells, apparently migrating from the stump to the amputation plane, remained there without dedifferentiating and integrating the blastema. In support of this idea is the observation that genes involved in new scleroblasts alignment, such as shh and ptc1 were downregulated precisely when bone cells accumulation started to be evident. These findings are consistent with the known role of shh in the alignment of scleroblasts. The role of nAG (newt anterior gradient protein), a secreted protein able to rescue a denervated blastema and induce regeneration of a denervated newt limb was investigated in this system. Interestingly, nAG does not seem to play the same role during zebrafish fin regeneration as during amphibian limb regeneration. nAG homologues (agr; agr0) were expressed only in the epidermis and were absent from the fin nerve. Moreover, after amputation agr2 and agr0 were still expressed in the epidermis both in control and denervated fins. This result suggests that regeneration may result from multiple, independent evolutionary origins, other than from a single origin. In order to gain insights into the molecular mechanisms underlying nerve dependency, a large-scale microarray screen was performed to compare innervated and denervated fins. Approximately 15.000 zebrafish transcripts were analyzed, identifying 1.535 transcripts as differentially expressed between control and denervated fins (776 up-regulated; 759 downregulated). Some of these differentially expressed genes have already been implicated in fin regeneration and were expected to be affect by denervation, however, the majority were new putative players not implicated previously in the fin regenerative process. Bioinformatic analysis was performed to evaluate the major pathways and cellular functions either activated or inhibited in denervated fins. The analyses of the results provided a comprehensive database of the molecular pathways involved during fin regeneration, as well homeostasis in the absence of nerves, which will serve as an important tool to describe in more detail the dynamics of nerve dependence and investigate the role of putative mitogenic growth factors and its targets. In order to investigate the impact of denervation on the blood vessels integrity and function, the regenerative process of the transgenic Tg(fli1a:EGFP) expressing GFP in endothelial cells was analyzed. The main difference observed between control and denervated fins was the absence of angiogenesis in the blastema of denervated fins. The integrity of blood vessels was apparently not affected by denervation. At the molecular level, only two receptors (robo1 and robo4) of the Slit neuronal guidance cue protein family that regulate vascular development, were downregulated. Therefore, the requirement of nerves during zebrafish fin regeneration does not seem to act via interaction with the vascular system, as it was hypothesized before. Nonetheless, this hypothesis needs further investigation, as there might be important interactions that influence blood vessel and blood circulation that this study did not address. To further investigate vertebrate nerve dependent regeneration, the zebrafish maxillary barbel was also studied to establish this structure as a new in vivo useful model to understand this process. Although it was not possible so far to develop a successful denervation protocol in this model, major breakthroughs have been accomplished at the methodological point of view. A detailed characterization of the morphology of intact and regenerating barbels revealed aspects of its structure never described before. It was developed an in situ hybridization and Alcian Blue staining protocols that worked in barbels, and it was demonstrated that the injection followed by electroporation is a feasible method for future functional studies in this structure. Overall, this study shows that zebrafish is a reliable and convenient model system to further investigate the molecular and cellular mechanisms behind nerve dependency during tissue regeneration. Understanding the function of nerves is crucial in devising strategies to induce regeneration in humans. This work may contribute to open new perspectives for biomedical applications in tissue repair.engPeixe-zebraBarbatanas de animaisRegeneraçãoTeses de doutoramento - 2013doctoral thesis101249870