Correia, Joana Rita SimõesCarlos, Ana Rita Cabral MartinsRibeiro, Sofia Carnide2024-04-2220242023http://hdl.handle.net/10451/64468Tese de Mestrado, Biologia Molecular e Genética, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA cosmética surge como resultado da busca pela beleza e pela preservação de uma aparência saudável, inerentes à sociedade humana. Em particular, a manutenção de uma pele saudável é um dos maiores focos desta indústria, já que os produtos de cuidados com a pele representam mais de um terço do total de cosméticos e estima-se que esse valor possa aumentar. Com o aumento da esperança média de vida, as mulheres passarão mais tempo no período pós-menopausa, caracterizado por baixos níveis de estrogénio que levam aos sinais de envelhecimento, assim como a pele mais sensível e seca. Desta forma, a procura por novos ingredientes ativos que melhorem a condição da pele é essencial para a indústria cosmética. Atualmente, essa procura tem em consideração o impacto humano nos ecossistemas, pelo que ingredientes sustentáveis que respondam às necessidades dos consumidores sem prejudicar o ambiente são valiosos. Neste contexto, surge o interesse de explorar o potencial cosmético de subprodutos industriais, uma vez que promovem uma economia circular. As vesiculas extracelulares são partículas desprovidas de núcleo delimitadas por uma membrana lipídica necessariamente libertadas por células. Estas partículas estão envolvidas em processos de comunicação celular e são secretadas por todos os organismos. Recentemente, vários investigadores observaram que, dependendo da fonte, as vesículas extracelulares apresentam propriedades rejuvenescedoras, antioxidantes e de clareamento da pele, identificando estas partículas como um possível novo ingrediente cosmético. Em vários destes estudos, foram utilizados organismos previamente reconhecidos pelos seus efeitos benéficos para a pele, como diversas macroalgas e plantas, cujas vesículas extracelulares também apresentavam propriedades cosméticas. Chlorella vulgaris é uma espécie de microalga com diversas aplicações industriais, incluindo na indústria de produtos de cuidados com a pele pelo seu potencial antioxidante, hidratante e rejuvenescedor, estimulando a produção de colagénio na pele. Apesar disso, o potencial das suas vesículas extracelulares para a cosmética não parece ter sido estudado até ao momento. As vesículas extracelulares são libertadas frequentemente durante o ciclo de vida dos organismos, pelo que é espectável que sejam libertadas para o meio de cultura durante a produção industrial desta microalga. Assim, esta tese foca-se no isolamento de vesículas extracelulares de meio de cultura industrial de C. vulgaris (CvEV) e na análise do seu possível efeito cosmético in vitro. Esta ideia apresenta-se como uma forma de encontrar novos possíveis ingredientes cosméticos em subprodutos industriais, promovendo uma inovação sustentável. Neste estudo, obtivemos CvEV usando métodos de isolamento distintos, recorrendo a ultracentrifugação (CvEV.0), ultrafiltração com membrana de poros com 100 kDa (CvEV.1) e ultrafiltração com membrana de poros com 500 kDa (CvEV.2). Também foi possível isolar CvEV recorrendo à ultrafiltração de poro com 500 kDa no dia seguinte à recolha do meio de cultura de C. vulgaris (CvEV.3). Todos os isolamentos foram apenas efetuados uma única vez, não sendo por isso possível comparar estatisticamente o conteúdo das amostras obtidas entre si. No entanto, mostrámos que o isolamento de CvEV é exequível através de métodos escaláveis num intervalo de tempo razoável após a conclusão do processo industrial de cultura de microalgas. Antes de iniciar a análise do potencial cosmético de CvEV, certificou-se que as partículas não interferiam com a atividade metabólica de queratinócitos ou fibroblastos humanos em cultura in vitro. Estas células foram escolhidas neste trabalho por serem os tipos celulares dominantes na epiderme e derme, respetivamente, as camadas mais superficiais da pele. Duas concentrações distintas de CvEV, 2x104 e 1x105 partículas/célula, foram testadas e nenhuma induziu toxicidade nem proliferação excessiva nas células, pelo que foi possível prosseguir para avaliação das propriedades cosméticas. Ao avaliar o potencial de CvEV para cosmética, foi necessário considerar as inúmeras possibilidades de atuação destas partículas na pele, assim como os principais pontos de interesse e objetivos da indústria, de uma forma pragmática. Assim, neste estudo escolhemos avaliar o potencial hidratante, rejuvenescedor, antioxidante e de reforço da epiderme das CvEV, com base nas linhas celulares presentes no laboratório e nas propriedades conhecidas de C. vulgaris. Para isso, recorreu-se a análise de expressão génica direcionada, por permitir analisar a transcrição de genes com importante valor cosmético após as células terem sido tratadas com CvEV, de uma forma acessível. Em queratinócitos, o potencial hidratante foi avaliado visando a expressão de aquaporina-3 (AQP3) e involucrina (IVL), enquanto em fibroblastos, a transcrição de uma sintase de ácido hialurónico (HAS) foi escolhida para esse propósito. O efeito de CvEV como possível ingrediente rejuvenescedor foi avaliado em fibroblastos verificando se a expressão de colagénio-1 (COL1A1) ou colagénio-3 (COL3A1) aumentava e a transcrição de metaloproteínase-1 (MMP1) diminuía, enquanto o seu potencial antioxidante foi estimado através da expressão génica de superóxido dismutase-1 (SOD1) em fibroblastos e catalase-1 (CAT1) em ambas as linhas celulares. Por fim, a possibilidade de CvEV reforçar a epiderme foi avaliada apenas em queratinócitos, examinando a expressão de queratina-5 (K5), queratina-10 (K10) e ocludina (OCL). Em geral, as CvEV não induziram mudanças na expressão dos genes analisados. No entanto, verificou-se que CvEV.2 levou a um aumento significativo de expressão de sintase de ácido de hialurónico-3 (HAS3), uma enzima envolvida na síntese de um glicosaminoglicano essencial no equilíbrio hídrico da pele, o que sugere um possível efeito hidratante de CvEV. É também de notar que CvEV.1 levou a uma diminuição da expressão de involucrina em queratinócitos basais. In vivo, este gene é expresso em queratinócitos terminalmente diferenciados, presentes nas camadas superiores da epiderme, uma vez que codifica para uma proteína essencial na impermeabilização do stratum corneum. Assim, a diminuição de expressão de involucrina em queratinócitos basais não invalida um possível efeito hidratante de CvEV. Por ter sido a primeira vez que o potencial de CvEV como ingrediente para a indústria de cuidados com a pele foi avaliado, recorreu-se a técnicas e modelos relativamente simples, de modo a explorar o máximo de possíveis efeitos promissores, de uma forma acessível. Desta forma, apenas foi estudado o efeito de CvEV a nível da expressão génica de células da pele, não permitindo concluir se estas partículas intervêm a jusante da transcrição em processos de regulação relevantes para a cosmética. Além disso, como o estudo foi desenvolvido em linhas celulares 2D, os resultados obtidos podem não ser equiparados ao efeito real das CvEV in vivo, pelo que modelos mais representativos da pele, como modelos 3D ou ex vivo, deverão ser utilizados em trabalhos seguintes. Para além das limitações acima referidas, este estudo compreendeu a análise de um número relativamente pequeno de genes e de parâmetros cosméticos, pelo que seria interessante expandir esse número recorrendo a tecnologias “ómicas”. Assim, o efeito de CvEV na pele poderia ser detetado utilizando uma abordagem de obtenção de dados a larga-escala não direcionada, uma vez que a sua ação é praticamente desconhecida. Nesta tese, foram isoladas vesículas extracelulares de um resíduo da indústria de microalgas e testadas quanto ao seu potencial como ingrediente para cuidados da pele, demonstrando que é possível procurar por novos ingredientes cosméticos usando subprodutos industriais. De facto, mostrámos que as vesículas extracelulares de uma variedade heterotrófica de C. vulgaris cultivada para ser utilizada em suplementos alimentares parecem apresentar propriedades hidratantes. Como tal, é espectável que este trabalho seja um ponto de partida para explorar o efeito cosmético de vesículas extracelulares de outras fontes industriais, incluindo outras variedades de C. vulgaris ou outras microalgas com valor industrial e cosmético, contribuindo assim para a formação de novas formas de fomentar a economia circular. Esta tese compreende uma das áreas de investigação da empresa Exogenus Therapeutics, onde a tese foi desenvolvida, o que evidencia novamente o interesse e pertinência deste trabalho.Cosmetics play a major role in society due to their impact on health, appearance, social interactions, and economic implications. In particular, skincare has gained popularity as life expectancy increases, since the concern for the skin rises and the demand for novel rejuvenating products expands. Moreover, there is currently the need to consider and minimize human ecological impact, hence the skincare industry is constantly aiming to find novel sustainable active ingredients that respond to consumer needs without harming the environment. Recently, it has been shown that extracellular vesicles have skincare potential depending on their cell of origin. Chlorella vulgaris is a microalga commonly produced for industrial applications that is known to have beneficial effects for the skin. During industrial production of C. vulgaris, the cells release extracellular vesicles to the culture medium, which is typically discarded after biomass collection. In this study, we isolated extracellular vesicles present in industrial C. vulgaris culture medium (CvEV) using distinct isolation methods and evaluated their skincare potential through targeted gene expression analysis. CvEV did not exhibit toxicity nor induced excessive proliferation on fibroblasts and keratinocytes in vitro. In addition, a possible moisturizing effect of CvEV was observed since one of the isolation methods resulted in particles that induced the upregulation of a hyaluronan synthase in fibroblasts. As far as we know, this was the first time that extracellular vesicles were isolated from a waste product of microalgae industry and tested for their skincare potential, demonstrating that it is possible to find novel cosmetic ingredients using industrial byproducts. We expect this work to be a starting point for finding skincare potential in extracellular vesicles derived from sustainable sources and industrial byproducts, hence promoting a circular economy.engVesículas extracelularesChlorella vulgarisCuidados com a peleSubproduto industrialEconomia circularTeses de mestrado - 2024master thesis203606345