Brito, Maria Alexandra de Oliveira Silva Braga Pedreira dePimentel, José Guilherme de Brito CortezFranco, Catarina Alexandra Correia2022-04-272022-04-272020-02-27http://hdl.handle.net/10451/52565Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2020The discovery of new drugs for brain pathologies is challenging, mainly due to the blood-brain barrier (BBB) that limits access of almost all molecules into the brain. In this context, glioblastoma (GB) remains an incurable disease owing to the presence of the BBB and the molecular heterogeneity of the tumor. Amplification and mutation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene represent signature genetic abnormalities encountered in GB, becoming an attractive target for therapeutic strategies. However, the activation of compensatory pathways that generates multiple inputs to downstream phosphatidylinositol 3’-kinase (PI3K) signaling may lead to acquired anti-EGFR therapeutic resistance. Specifically, PI3Kp110β subunit was recently described as the dominant catalytic subunit that dictates downstream signaling with strong association to recurrence rate, risk, and prognosis, thereby becoming a selective survival factor for GB never previously addressed. Hence, designing BBB-penetrant novel therapeutics that target multiple kinases is crucial to overcome these obstacles. The aim of this work was the development of a new cost- effective in silico strategy to predict the ability of candidate molecules to overcome the BBB and inhibit the EGFR/PI3Kp110β pathway in a multi-targeting approach, followed by their experimental validation as strong clinical candidates for GB treatment. An automated and expandable framework and machine learning methods were used to build three quantitative structure–activity relationship (QSAR) models with reduced prediction error (RMSE) and high percentage of variance explained (PVE): BBB permeability (RMSE=0.3, PVE=0.55), inhibition of EGFR (RMSE=0.17, PVE=0.70) and inhibition of PI3Kp110β (RMSE=0.16, PVE=0.71). The optimal predictive performance of produced models was achieved using vectoral representation of molecules by AtomPair fingerprint and a newly feature selection method random forest-based. These models were used in a virtual screening of ZINC15 commercial database with more than 35 million compounds, from which the most promising candidate molecules were selected. The analysis of the molecular space of candidate molecules proved their fitness in models applicability domain and their projection in most likely-active regions, translated by high probabilities of surface for molecular activity when considering d(x,y)max to training instances of 0.7. For each protein target was validated a 3D structural model (EGFR, r2=0.9036, RMSD=1.251; PI3Kp110β, r2=0.8811, RMSD=0.342) to perform a docking simulation and evaluate the interaction of selected molecules with the respective target. Finally, ADMET profiles were accessed to ascertain their drug-like phenotype, allowing the identification of 27 hit molecules to further biological testing, namely 18 candidates for EGFR, 6 for PI3Kp110β and 3 for dual inhibition of both targets. A high-throughput screening was performed in two human GB cell lines, U87MG parental and U87MG transfected to overexpress wild-type EGFR, and for the settled iv threshold at 50% cell viability 6 highly cytotoxic molecules were selected, with LD50s in the <130 μM range. All molecules were significantly more powerful than clinically relevant inhibitors targeting EGFR (gefitinib, lapatinib, dasatinib, imatinib) or PI3K (alpelisib, idelalisib). We found significant inhibition of phosphor-EGFR and phosphor-Akt (downstream PI3K’ substrate) in both cell lines compared to vehicle-treated controls, which was translated in an increased apoptosis along time (15-85% after 9h of treatment, P<0.001). Three of those selective inhibitors proved to be completely innocuous for human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) from BBB, without causing significant changes in junctional (β-catenin and zonula occludens-1) and cytoskeleton (F-actin) proteins expression. Moreover, those molecules were not substrate-like of P-glycoprotein efflux transporter and proved to cross the BBB’s endothelium as predicted by in sillico analysis (mol 8 logBB = 0.66, mol 19 logBB = 0.30, mol 20 logBB =-0.20, at 120 min of incubation) through high efficient transport rout (18.47 %, 13.39 %, and 1.87 %, respectively) without compromising HBMEC monolayer integrity, attested by trans-endothelial electrical resistance measurements. In a robust BBB-GB co-culture system, molecules were also highly cytotoxic inducing a decrease in GB cell viability of 25-50% even under short incubation times. Overall, these results revealed that our in-silico strategy is a valuable approach with high predictive performance to speed up the drug discovery process. Moreover, the identified small-molecules targeting EGFR and PI3Kp110β represents viable therapeutic strategies for primary GB that future in vivo studies should settle in tumor-bearing mouse models. Not least important is the fact that our model building approach can be used in the study of any brain pathology only by adapting the input parameters of the developed framework, saving time and resources towards developing novel therapeutics.O glioblastoma (GB) é o tumor cerebral primário mais comum e agressivo em adultos cuja natureza invasiva dificulta ressecções cirúrgicas completas e que, juntamente com a ausência de terapêutica eficaz, o torna uma doença incurável com elevada taxa de mortalidade. A falta de um tratamento eficaz para o GB tem sido associada à complexa heterogeneidade molecular do tumor e ao facto de este se encontrar numa localização privilegiada protegida pela barreira hematoencefálica (BHE), responsável por limitar o acesso da maioria dos compostos ao encéfalo, e consequentemente ao tumor. A BHE apresenta uma panóplia de características únicas responsáveis pela sua permeabilidade restrita, nomeadamente a expressão de uma complexa rede de junções celulares e transportadores seletivos, tornando-se um dos maiores desafios que a neurofarmacologia tem de ultrapassar no tratamento de patologias do sistema nervoso central (SNC). Atualmente, apenas cerca de 2% das moléculas com potencial terapêutico conseguem atravessar a BHE. Paralelamente, a natureza heterogénica do GB cria o potencial para subpopulações de células tumorais com resistência terapêutica sobreviverem e evoluírem quando expostas a mono-terapias, aumentando a taxa de recorrência face à refratariedade do tratamento. Neste contexto, o GB primário é largamente associado a alterações genéticas no recetor do fator de crescimento epidermal (EGFR) que conduzem à sua ativação constitutiva e consequente desregulação de vias com potencial oncogénico envolvidas na proliferação celular e sobrevivência, tornando-se um alvo terapêutico atrativo. Contudo, a ativação de vias compensatórias que geram múltiplos inputs para ativação de phosfatidil-inositol-3-cinase (PI3K) conduz comummente à resistência a terapêuticas anti-EGFR. A subunidade PI3Kp110β foi recentemente descrita como o domínio catalítico com maior contribuição para ativação da via a jusante através da fosforilação de AKT, com forte associação a recorrência, risco e prognóstico, emergindo assim como um alvo relevante em GB que, até hoje, nunca foi explorado. Embora este contexto desafiador impulsione o desenvolvimento de novas moléculas, este é ainda um processo muito caro e demorado, onde a maioria dos compostos desenvolvidos nem sequer chegam a ser comercializados. Com efeito, torna-se emergente o desenvolvimento de uma nova abordagem que permita reduzir o tempo e custo da investigação assim como aumentar a sua eficiência, para a qual técnicas modernas in silico podem contribuir. Estudos computacionais possibilitam predizer atividades biológicas e propriedades físico- químicas por meios racionais, assim como a compreensão e suposição do mecanismo de ação de séries congéneres. Por conseguinte, esta tese baseou-se no desenvolvimento de uma nova estratégia in silico capaz de prever a capacidade de moléculas atravessarem a BHE e inibirem a via EGFR/PI3Kp110β numa estratégia multialvo, seguida da validação experimental das moléculas selecionadas enquanto potenciais candidatos clínicos para o tratamento de GB. Foi utilizada uma framework automatizada e métodos de aprendizagem automática para construir três modelos de relação quantitativa de estrutura-atividade (QSAR) com baixo erro de previsão (RMSE) e elevada percentagem de variância explicada (PVE): permeação da BHE (RMSE=0.3, PVE=0.55), inibição de EGFR (RMSE=0.17, PVE=0.70) e inibição de PI3Kp110β (RMSE=0.16, PVE=0.71). A elevada performance preditiva dos modelos desenvolvidos foi obtida pela representação vetorial das moléculas através do fingerprint AtomPair aliado a um novo método de seleção de descritores baseado em árvores de decisão. Os modelos resultantes suportaram um screening virtual da base de dados ZINC15, que contém mais de 35 milhões de compostos, a partir do qual foram selecionadas as moléculas mais promissores. A análise do espaço molecular das moléculas selecionadas demonstrou a sua inclusão no domínio de aplicabilidade dos modelos assim como a sua disposição nas regiões do espaço mais prováveis de serem ativas, o que pode ser traduzido pela obtenção de elevadas probabilidades de atividade molecular para um limiar de d(x,y)max = 0.7. No geral, os candidatos identificados a partir do screening apresentam excelentes previsões de atividade sobre os alvos considerados (5.6 < -pIC50 < 8.3), assim como elevada permeabilidade através da BBB (-0.1 < logBB < 0.5). Para cada alvo foi construído e validado um modelo estrutural tridimensional (EGFR, r2=0.9036, RMSD=1.251; PI3Kp110β, r2=0.8811, RMSD=0.342) que serviu de base para os estudos de docking molecular que possibilitaram a avaliação das interações das moléculas selecionadas com os alvos. Por conseguinte, as moléculas candidatas apresentaram baixas energias e elevada eficiência (>2) de ligação assim como poses nos centros ativos que permitem reproduzir a maioria das ligações descritas como necessárias para a inibição dos alvos. Várias propriedades de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade (ADMET) foram também avaliadas, o que suportou a existência de perfis moleculares farmacologicamente favoráveis entre o pool de candidatos, destacando- se baixos pesos moleculares, ótima solubilidade lipídica, baixa área de superfície polar, boa difusão através da barreira intestino-sangue, boa absorção oral, ausência de potencial carcinogénico, entre outros. Considerando todos os estudos preliminares e uma panóplia de critérios de seleção, 27 moléculas foram selecionadas para prosseguirem com os estudos experimentais, nomeadamente 18 candidatos para EGFR, 6 para PI3Kp110β e 3 para a dupla inibição de ambos os alvos. Todas as moléculas foram testadas em várias concentrações em duas linhas celulares de GB, U87MG parental e U87MG transfetada para sobreexpressar o gene EGFR, e considerando um limiar de viabilidade celular de 50%, foram selecionadas as 6 moléculas mais citotóxicas com LD50s < 130 μM. As moléculas selecionadas foram consideravelmente mais potentes em relação a outros inibidores clinicamente relevantes que atuam em EGFR (gefitinib, lapatinib, dasatinib, imatinib) ou PI3K (alpelisib, idelalisib), assim como em relação à temozolomida (TMZ), o agente quimioterapêutico mais comummente utilizado no tratamento de GB. Após um extenso ensaio de imunofluorescência e análise de microscopia, foi observada uma inibição significante da fosforilação de EGFR e AKT (substrato de PI3K) em células U87MG tratadas com as moléculas comparativamente aos controlos, traduzindo-se num forte aumento da morte celular ao longo do tempo (15-85% após 9h de tratamento, P<0.001). Estes resultados permitiram não só validar a especificidade das moléculas na inibição dos alvos considerados, como permitiram desvendar PI3Kp110β como um novo alvo terapêutico em GB e revelar pela primeira vez potenciais co-inibidores de EGFR/PI3K que, até à data, nunca foram identificados. Três das moléculas testadas exibiram efeitos tóxicos massivos nas células endoteliais humanas da microvasculatura cerebral (HBMEC), razão pela qual foram excluídas dos seguintes estudos, equacionando-se o seu futuro encapsulamento em nanopartículas que permitam a permeação da BBB e atuação especifica nas células de GB. Por outro lado, as restantes moléculas selecionadas não causaram qualquer toxicidade nas HBMEC, suportado pela ausência de redução da viabilidade celular e de alterações na expressão de proteínas das junções celulares (β-catenina, zonula occludens-1) ou do citoesqueleto (F-actina). As moléculas mostraram não ser substrato do transportador de efluxo P-glicoproteína, o que aumenta a hipótese de haver uma exposição adequada da molécula à área tumoral, e provaram conseguir atravessar o endotélio da BBB (mol 8 logBB = 0.66, mol 19 logBB = 0.30, mol 20 logBB =-0.20, após 120 min de incubação) com alta eficiência (18.47 %, 13.39 %, e 1.87 %, respetivamente) sem comprometer a integridade da monocamada de HBMEC, sustentado por medições da resistência trans-endotelial elétrica. Num modelo robusto de co-cultura, as três moléculas consideradas provaram mais uma vez ser significantemente citotóxicas ao atravessarem a BBB e induzirem uma redução da viabilidade celular de 25-50%, mesmo considerando pequenos tempos de incubação. No geral os resultados obtidos experimentalmente correlacionaram-se de forma linear com as previsões in silico (r2 = 0.9657-0.9999), suportando uma elevada qualidade preditiva e aplicabilidade dos modelos empíricos produzidos. Sumariamente, estes resultados sustentam a estratégia in silico desenvolvida com base em modelos QSAR, simulações de docking, análise de espaços moleculares e previsão de perfis ADMET, como uma abordagem valiosa para identificar moléculas com potencial efeito anti-tumoral para o tratamento de GB, contribuindo assim para acelerar o processo de descoberta de novos fármacos. Notavelmente, a estratégia utilizada para a automatizar a produção de modelos preditivos é totalmente flexível e extensível, podendo ser adaptada para o estudo de qualquer patologia neurológica, poupando tempo e recursos viii no processo de descoberta de novos fármacos. Por fim, as moléculas identificadas neste estudo representam uma estratégia terapêutica viável para o tratamento de GB, com elevada taxa de transporte através da BBB e forte atividade inibitória dos alvos, traduzindo- se num enorme potencial anti tumoral. Estudos futuros deverão focar-se na avaliação da sua eficácia in vivo, esperando-se obter todas as condições para entrar em futuros ensaios clínicos. Os resultados obtidos fundamentam ainda a possível patenteação e/ou reaproveitamento das moléculas identificadas que podem vir a atualizar o mercado farmacêutico para revolucionar o tratamento do GB e, ultimamente, a qualidade de vida dos pacientes.engBlood-brain barrierGliobastomaQSAR predictive modelingDocking simulationADMET propertiesSmall-molecules kinase inhibitonNeurosciencesTeses de mestrado - 2020master thesis202449467