Santos, Susana Isabel Rodrigues dosGaspar, Maria Manuela de Jesus GuilhermeHermosilha, Daniela Sofia Curto2025-05-292025-05-292025-04-292025-03-28http://hdl.handle.net/10400.5/101140Tese de mestrado, Engenharia Farmacêutica, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de FarmáciaA pele é o maior órgão do corpo humano, desempenhando um papel fundamental como barreira protetora contra agentes patogénicos e diversas agressões ambientais como radiação ultravioleta, poluentes atmosféricos e substâncias irritantes. Quando esta estrutura é comprometida, por fatores externos ou internos, podem surgir doenças cutâneas de origem inflamatória, cuja prevalência na população mundial é significativa. Como forma de combater esses problemas, existem cada vez mais abordagens terapêuticas, com particular destaque para o uso de recursos naturais. Os produtos de origem natural são extremamente importantes a nível tópico, pela sua atividade antioxidante, ajudando a reduzir o fotoenvelhecimento, mas também pela sua ação anti-inflamatória, que contribui para reduzir a vermelhidão e o inchaço. Entre estes recursos, os óleos essenciais extraídos de plantas destacam-se como potenciais agentes terapêuticos, devido às suas propriedades biológicas benéficas. Um exemplo relevante é o óleo essencial de tomilho, amplamente reconhecido pela sua ação antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória, tornando-se uma opção promissora para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas naturais no cuidado da pele. Deste modo, o objetivo desta tese foi desenvolver um suporte científico em relação à potencial atividade anti-inflamatória do óleo essencial proveniente de uma das espécies de tomilho, Thymus mastichina, com especial ênfase nas suas frações purificadas de interesse. Além do estudo da atividade anti-inflamatória, a atividade antioxidante das formulações foi também estudada, seguindo-se estudos de segurança e eficácia para comprovar o seu potencial ao nível da inflamação. Para este fim, o óleo essencial de Thymus mastichina foi extraído por hidrodestilação, usando o aparelho Clevenger. Seguidamente, o óleo essencial foi fracionado através de Cromatografia de Partição Centrífuga (CPC), uma tecnologia que permite a separação seletiva de compostos com estruturas químicas semelhantes, possibilitando a obtenção de frações enriquecidas em componentes específicos para posterior avaliação biológica. A planta seca, hidrodestilado e as frações purificadas foram caracterizados por Cromatografia Gasosa-Espetrometria de Massa (CG-EM), sendo identificados e quantificados os terpenos presentes em cada um dos materiais. Subsequentemente, as frações de maior interesse, selecionadas com base na composição de terpenos com potenciais propriedades anti-inflamatórias foram combinadas de forma estratégica originando as frações de interesse (FA, FB e FC) utilizadas nos ensaios subsequentes, com o objetivo de avaliar o seu potencial anti-inflamatório. Foi realizado um ensaio de quantificação de fenólicos totais, seguido da avaliação da atividade antioxidante pelo método de 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), permitindo estimar a capacidade das frações de interesse em neutralizar radicais livres. Para avaliar a segurança das frações de interesse FA, FB e FC, foi realizado o ensaio in vitro utilizando a linha celular imortalizada de queratinócitos humanos (HaCaT). A viabilidade celular foi determinada utilizando o ensaio do 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT), aplicado a três concentrações diferentes das frações de interesse, de forma a avaliar potenciais efeitos citotóxicos e estabelecer a sua segurança para aplicações tópicas. Nesta fase do estudo, foi proposta a incorporação de uma mistura de canabinóides para avaliar o seu potencial efeito anti-inflamatório nas células HaCaT. Assim sendo, a atividade antiproliferativa da mistura de canabinóides e das frações de interesse (FA, FB e FC), isoladamente e em combinação com a mistura foi testada a uma determinada concentração, permitindo avançar para os ensaios de eficácia utilizando marcadores moleculares genéticos. Para a avaliação da eficácia das frações de interesse, foi analisado o seu efeito sob condições terapêuticas através da indução de inflamação por forbol-12-miristato-13-acetato (PMA), um agente que desencadeia um elevado nível de inflamação. Posteriormente, a análise de expressão genética de marcadores moleculares na presença das frações de interesse isoladas e em combinação com a mistura de canabinóides foi avaliada, através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (RT-qPCR) usando sondas TaqMan. As duas frações FB e FC, que demonstraram melhores resultados de eficácia in vitro, foram selecionadas para incorporação num gel à base de Carbopol® 940 tanto isoladamente como em combinação com a mistura de canabinóides. As formulações tópicas foram caracterizadas em termos de características organoléticas, pH, propriedades reológicas e estabilidade. No sentido de avaliar a segurança das frações de interesse isoladas e a sua eventual toxicidade ambiental, foi utilizado o modelo in vivo de Artemia salina. Seguiu-se os testes no modelo animal de inflamação aguda para avaliar a eficácia in vivo das duas melhores frações de interesse isoladas (FB + FC) e em combinação com a mistura de canabinóides (FB + mix e FC + mix). Por fim, após a avaliação do potencial anti-inflamatório das frações de interesse, propôs-se a realização de um ensaio preliminar da atividade microbiológica, com o objetivo de avaliar a capacidade das formulações em inibir o crescimento microbiano. Para tal, as frações de interesse foram testadas contra estirpes bacterianas e uma estirpe fúngica representativas da pele. A hidrodestilação do óleo essencial de Thymus mastichina demonstrou ser um método eficiente, garantindo a pureza e o rendimento do óleo essencial para os passos subsequentes. Por técnica de CPC, foi possível separar eficientemente terpenos, originando várias frações diferenciadas por diferentes terpenos. As frações foram combinadas em frações de interesse, FA, FB e FC. Por análise CG-EM confirmou-se a sua composição química, sendo FA, enriquecida em timol e linalol, FB, contendo eucaliptol e α-terpineol, e FC, contendo γ-terpineno e terpinoleno como compostos maioritários. A quantificação de compostos fenólicos demonstrou a ausência total de fenóis na FA, FB e FC, uma vez que o método de extração usado, é direcionado a compostos voláteis, não sendo adequado para a extração de compostos fenólicos. A determinação da atividade antioxidante pelo método DPPH demonstrou uma elevada redução de DPPH com 96.58 ± 0.01 % para a FA, uma moderada atividade antioxidante para a FC com 50.40 ± 0.11 %, e por último, uma reduzida redução de DPPH para a FB com 9.40 ± 0.58 %. A avaliação da citotoxicidade de FA, FB e FC na linha celular HaCaT, demonstrou valores de viabilidade celular superiores a 70 % em todas as concentrações testadas. O mesmo foi demonstrado para a mistura de canabinóides (mix) com as frações de interesse FA, FB e FC (FA + mix, FB + mix e FC + mix). A análise por RT-qPCR comprovou que, após a indução inflamatória com PMA, as frações FB e FC apresentaram melhores resultados de eficácia in vitro. A mistura das mesmas incluindo os canabinóides promoveram uma redução significativa da expressão dos marcadores moleculares pró-inflamatórios (interleucina-6 (IL-6), fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucina-36 gama (IL-36G)). Entre as combinações testadas, a FB + mix, apresentou os melhores resultados, destacando-se como a combinação mais eficaz para a modulação da resposta inflamatória. Com base nestes resultados, as frações FB e FC isoladas e em combinação com os canabinóides foram selecionadas para a sua inclusão, num gel à base de Carbopol® 940 para testes in vivo num modelo de inflamação aguda. Por sua vez, o ensaio de segurança in vivo pelo modelo Artemia salina demonstrou a segurança das frações de interesse, com uma taxa de mortalidade inferior a 8 %. Os estudos in vivo no modelo animal confirmaram os efeitos anti-inflamatórios observados in vitro, demonstrando uma redução significativa do edema após o tratamento com as formulações testadas. FC + mix apresentou a maior redução do oedema, FC promoveu uma redução moderada, FB + mix demonstrou uma inibição do oedema e FB reduziu o oedema (embora tenha sido ligeiramente mais eficaz quando combinada com a mistura de canabinóides), indicando que as formulações contendo a FC + mix, FB e FB + mix apresentam uma eficácia comparável a um produto anti-inflamatório já estabelecido. A combinação das frações de interesse de óleo essencial (FA, FB e FC) com canabinóides potencializou significativamente os efeitos anti-inflamatórios, com FB + mix destacando-se na supressão de citocinas inflamatórias e FC + mix apresentando a maior redução do edema in vivo. Os resultados sugerem que a modulação dos recetores canabinóides (recetor canabinóide tipo 1 (CB1) e recetor canabinóide tipo 2 (CB2)) associada às vias anti-inflamatórias mediadas por terpenos pode ser uma estratégia promissora para o tratamento de doenças cutâneas inflamatórias. Em suma, é possível concluir que as frações de interesse do óleo essencial de Thymus mastichina foram devidamente caracterizadas e apresentaram resultados pertinentes ao longo deste estudo, comprovando a sua segurança em ensaios in vitro e in vivo, assim como a sua eficácia. Adicionalmente, a inclusão da mistura de canabinóides mostrou-se particularmente relevante na aplicação aos modelos in vitro e in vivo, demonstrando assim que a formulação de gel com a incorporação da FC + mix foi a mais promissora para o estudo da inflamação aguda. O objetivo deste trabalho foi assim cumprido, evidenciando a atividade anti-inflamatória dos compostos voláteis presentes nas formulações, bem como a possível atividade anti-inflamatória da mistura de canabinóides.Skin diseases of inflammatory origin, such as atopic dermatitis, psoriasis and acne, have a substantial prevalence in the world population. Natural products are particularly important at a topical level, helping to reduce photoaging and inflammation. In addition, these resources also have anti-inflammatory activity. Essential oils are examples of natural products, such as thyme that is used for medicinal purposes due to its anti-inflammatory and antioxidant properties. The objective of this study was to evaluate the anti-inflammatory potential of Thymus mastichina essential oil, with a particular focus on its purified fractions. Three key fractions of interest were selected and designated as FA, FB and FC, based on their major bioactive compounds: FA (thymol/linalool), FB (eucalyptol/α-terpineol), and FC (γterpinene/terpinolene). The antioxidant activity showed a high reduction of 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH) for FA, followed by FC, and FB. All fractions of interest demonstrated in vitro safety in the human keratinocyte cell model (HaCaT). To potentially enhance their biological activity, a cannabinoid mixture was incorporated into the fractions of interest and tested using the same model. Efficacy testing in HaCaT cells using genetic molecular markers showed that the cannabinoid mixture significantly enhanced the inhibition of pro-inflammatory pathways rather than directly increasing anti-inflammatory responses. Based on these findings, FB and FC emerged as the most promising fractions from the in vitro efficacy evaluation and were then incorporated into the cannabinoid mixture and incorporated into a topical formulation based on Carbopol gel. The safety of the fractions of interest alone was further confirmed in vivo using the Artemia salina toxicity assay. Finally, the topical formulations, either alone (FB or FC) or in combination with the cannabinoid mixture (FB + mix or FC + mix), were tested in an acute inflammatory in vivo model, demonstrated to have antiinflammatory properties, supporting their potential therapeutic applications for inflammationrelated skin conditions.engAnti-inflammatory activityNatural productsSkin diseasesThymus mastichinaTeses de mestrado - 2025master thesis203943198