Lebeck, JanneRodrigues, Maria da Graça Tavares Rebelo de SoveralLamsal, Aakriti2023-07-062023-07-062022-11-162022-09-15http://hdl.handle.net/10451/58487Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.As aquagliceroporinas são proteínas canais transmembranares que facilitam o transporte de pequenos solutos, como o glicerol, para além da água. Alguns estudos reportaram a expressão de aquagliceroporina 7 (AQP7) em tecidos de fígado humano e murino. No entanto, outros estudos contradizem esses resultados mostrando muito baixa ou nenhuma expressão do canal de glicerol AQP7 no fígado. Para esclarecer esses resultados contraditórios, foi reavaliada a localização celular e subcelular de AQP7 no fígado humano e foi investigado se um padrão de expressão semelhante seria encontrado em células de Hepatoma G2 Humano (HepG2) usando marcação dupla de imunofluorescência com anticorpos bem validados. Além disso, o papel funcional da AQP7 também foi investigado. Os resultados mostram uma forte marcação da AQP7 em hepatócitos, no domínio da membrana plasmática apical dos colangiócitos que revestem o ducto biliar, enquanto que as células sinusoidais revelaram uma marcação fraca. A marcação para AQP7 em hepatócitos foi intracelular, predominantemente confinada à região perivenosa. A imunofluorescência dupla revelou a co-localização parcial de AQP7 com a proteína perilipina-2 associada a gotículas lipídicas (Plin2). Uma sobreposição quase completa foi observada entre a dinactina, uma proteína associada ao microtúbulo, e a AQP7. Além disso, a expressão de mRNA e proteína AQP7 foi confirmada em HepG2 por PCR, immunoblotting e imunocitoquímica. No entanto, em células HepG2, a localização de AQP7 não foi semelhante à encontrada em hepatócitos em tecido hepático humano. As células HepG2 tratadas com ácidos gordos livres (FFA) revelaram uma expressão aumentada de Plin2 dependente da concentração, mas não foi observada qualquer alteração significativa na expressão de AQP7 em células HepG2 tratadas com FFA. Em conclusão, a evidência de co-localização de AQP7 com dinactina indica que AQP7 é expressa em estruturas que são transportadas ao longo do microtúbulo, enquanto a co-localização de AQP7 com Plin2 aponta para um papel de AQP7 no armazenamento de lípidos no fígado. O envolvimento de AQP7 no armazenamento de lípidos também é sugerido pela expressão abundante de AQP7 na região perivenosa que é o principal local para a síntese de triacilglicerol (TAG).Aquaglyceroporins are pore-forming transmembrane proteins that facilitate the transport of small solutes such as glycerol in addition to water. Some studies have reported expression of aquaglyceroporin 7 (AQP7) in both human and murine liver tissues. However, other studies have contradicted these findings showing very low or no expression of the glycerol channel AQP7 in liver. Taking into account these contradictive results, we re-evaluated the cellular and subcellular localization of AQP7 in human liver and determined whether a similar expression pattern was found in Human Hepatoma G2 (HepG2) cells by using immunofluorescence double labelling with well-validated antibodies. In addition, the role of AQP7 was also investigated. Results show marked labelling for AQP7 in hepatocytes, apical plasma membrane domain of the cholangiocytes lining the bile duct while few prominent labelling was observed in sinusoidal cells. The labelling for AQP7 in hepatocytes was intracellular predominantly confined to the perivenous region. Double immunofluorescence revealed the partial colocalization of AQP7 with lipid droplet associated protein perilipin-2 (Plin2). Almost a complete overlap was observed between the microtubule associated protein, dynactin and AQP7. Further, mRNA and protein expression of AQP7 in HepG2 was confirmed by PCR, immunoblotting and immunocytochemistry. However, in HepG2 cells, the localization of AQP7 was not similar to that found in hepatocytes in human liver tissue. Free fatty acid (FFA) treated HepG2 cells demonstrated increased expression of Plin2 in a concentration dependent manner. No significant change in the expression of AQP7 in FFA treated HepG2 cells was seen. In conclusion, evidence of AQP7 co-localizing with dynactin indicates that AQP7 is expressed in structures that are transported along the microtubule whereas co-localization of AQP7 with Plin2 points towards a role of AQP7 in lipid storage in liver. The involvement of AQP7 in lipid storage is also suggested by the abundant expression of AQP7 in the perivenous region which is the major site for triacylglycerol (TAG) synthesis.engAquaglyceroporinAQP7Perilipin 2Human liverTriacylglycerolTeses de mestrado - 2022master thesis203198549