Ferreira, Humberto Eduardo de Carvalho SantosBordado, JoãoSantos, Ana Catarina Loução2022-05-112022-05-112021-07-142021-06-30http://hdl.handle.net/10451/52877Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Os ácidos biliares são produtos do catabolismo do colesterol, que existem no organismo humano sobre a forma livre ou conjugada, nomeadamente com as moléculas taurina ou glicina, e desempenham inúmeras funções, com particular destaque ao nível da digestão das gorduras e na sinalização química de diversos processos endógenos. As separações convencionais de ácidos biliares via HPLC-MS/MS usam solventes acídicos na composição da fase móvel, contendo ácido fórmico ou ácido acético, com o objetivo de diminuir a polaridade e ionização das suas cadeias laterais. As separações cromatográficas convencionais promovem uma ordem de saída de acordo com o grupo conjugado ou forma livre de cada ácido biliar (tauroconjugados, glicoconjugados e livres), sendo que dentro de cada grupo os ácidos biliares aparecem por ordem de polaridade do seu núcleo esteróide. A nova separação proposta neste trabalho usa uma fase móvel composta por quatro solventes: isopropanol, acetonitrilo, acetato de amónio a 10 mM e água, que ao substituir a componente aquosa acídica por uma básica, potencia a ionização das moléculas (aumentando o sinal em MS/MS, em modo negativo) e altera a ordem de saída dos ácidos biliares, passando esta a ser determinada pelo número de grupos hidroxilo dos compostos e da sua posição relativamente ao plano médio da molécula. Com o estudo e aplicação de diversas composições percentuais da fase móvel, e com recurso ao software de otimização JUMP, foi obtida uma composição otimizada da fase móvel que melhor permite a separação dos ácidos biliares, através da diferença dos tempos de retenção entre os compostos di-hidroxilados (ácido quenodesoxicólico e ácido desoxicólico), nas suas formas conjugadas com taurina e glicina. Essa otimização permite definir uma composição de fase móvel robusta que, mesmo sofrendo pequenas variações percentuais de cada um dos seus componentes, não afeta a qualidade da separação. A otimização estatística baseia-se em Modelos Response Surface (RSM), suportados por sistemas de equações quadráticas a quatro incógnitas (composição dos quatro componentes da fase móvel), partindo de um design-of-experiments (DoE) I-Optimal com o objetivo de reduzir o número de experiências necessárias à otimização.Bile acids (BA) are products of the catabolism of cholesterol. They exist in the human body in free or conjugated form (mainly with glycine and taurine), and function as facilitators of the digestion of fats and as endogenous chemical signals among several organs and cells. Conventional chromatographic separations of BA are conducted by HPLC-MS/MS using acidic mobile phases (containing formic or acetic acid) as a way of reducing the polarity and ionization of their side chains, in their free and conjugated forms. The separations promote an elution order based on the conjugation or free form groups (tauroconjugates, glycoconjugates and free BA), and within each group the elution is by polarity of the steroid nucleous. The new proposed separation uses a mobile phase composed of four solvents: isopropanol, acetonitrile, 10mM ammonium acetate and water. By substituting the acidic water phase by a basic water phase, the ionization of BA increases (thereby increasing their signal in MS/MS detection, in negative mode) and the elution order is profoundly changed, so that they now elute by number, and position in relation to the medium plane, of hydroxyl groups in the steroid nucleous. Several compositions of the mobile phase were studied based on suggestions generated by the software JUMP and an optimized mobile phase was obtained by focusing attention on the differences of retention time among di-hydroxylated BA (chenodeoxycholic and deoxycholic acids) in the taurine and glycine conjugated forms. The optimized mobile phase is robust in relation to small variations in the composition of the four components maintaining an adequate resolution of BA while in operation. The statistical optimization uses Response Surface Models (RSM), supported by systems of four quadratic equations with four variables (components of the mobile phase). The Design-of-Experiments (DoE) uses na I-optimal design to reduce the number of experiments necessary to produce the optimization.porÁcidos biliaresHPLC-MS/MSOptimizaçãoRSMI-OptimalMestrado integrado - 2021master thesis202985180