Correia, Isabel SáTenreiro, Ana Maria Moura Pires de Andrade, 1952-Godinho, Cláudia Sofia Pires, 1990-2013-03-082013-03-082012http://hdl.handle.net/10451/7938Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012 [versão pública]A resistência a múltiplas drogas é a resistência simultânea de um organismo a uma vasta gama de compostos químicos tóxicos estruturalmente e funcionalmente não relacionados. A compreensão deste fenómeno é de extrema importância, pois provoca problemas graves em diversas áreas, como por exemplo na preservação dos alimentos, no tratamento do cancro e de doenças infecciosas e na proteção química das colheitas. Por outro lado, este fenómeno pode também ter consequências positivas, como seja a capacidade de microrganismos industriais tolerarem o stress induzido por produtos do metabolismo cuja produção é desejada (por exemplo a produção de etanol durante a fermentação alcoólica de bebidas fermentadas ou produção de bioetanol). Existem vários mecanismos associados à aquisição de resistência a múltiplas drogas, entre eles a ação de bombas de efluxo presentes na membrana plasmática das células, sendo este um mecanismo altamente conservado. Em levedura, existem duas superfamílias de transportadores que conferem resistência a múltiplas drogas: a superfamília de transportadores “Major Facilitator” (MFS) e a superfamília de transportadores “ATP-binding cassette” (ABC). Pdr18 é um transportador da superfamília ABC responsável pela resistência da levedura a múltiplos compostos como os herbicidas ácido diclorofenóxiacético (2,4-D) e barban, o fungicída agrícola mancozeb e cádmio, cobre, manganésio, zinco, os agentes antineoplásicos cisplatina e carboplatina e o antifúngico nocodazole. Recentemente, no nosso laboratório, foi atribuído ao Pdr18 um papel na incorporação de ergosterol na membrana plasmática das células de levedura e este transportador foi o único, de entre um grupo de 21 transportadores das superfamílias MFS e ABC, que se verificou conferir resistência a concentrações inibitórias de etanol. Neste estudo foi confirmado e clarificado o papel deste transportador ABC na resistência a etanol. Os resultados deste trabalho mostram que o Pdr18 é responsável pela diminuição do nível de permeabilização das células de levedura induzida pelo etanol. Foi construída e caracterizada uma estirpe que sobre-expressa, no genoma, o gene PDR18 (BY4741_+PDR18), na qual o seu promotor natural foi substituído pelo promotor do gene PDR5 do mesmo organismo originando uma expressão basal do gene PDR18 superior à que este tem na estirpe selvagem. Esta estirpe modificada é mais tolerante a concentrações elevadas de etanol, permitindo o crescimento celular para concentrações de etanol perto das letais para a estirpe selvagem e diminuindo a permeabilidade celular de células sujeitas a etanol, apresentando as células geneticamente modificadas uma menor permeabilidade face à estirpe original, mesmo em condições controlo. O uso da estirpe mais robusta levou à produção de concentrações mais elevadas de etanol atingidas durante a fermentação alcoólica e este melhor desempenho da atividade fermentativa foi relacionado com a menor permeabilização celular da estirpe BY4741_+PDR18 induzida por etanol. A estratégia adoptada neste estudo apresenta-se como uma boa opção para a manipulação da expressão deste gene em estirpes industriais, dado que o promotor do gene PDR5 leva a um aumento da expressão do gene PDR18 durante a fermentação alcoólica quando comparado com o promotor natural do gene. Outra vantagem desta estratégia prende-se com a possibilidade de utilizar esta nova estirpe em meio muito rico, semelhante ao utilizado industrialmente para fermentação, dado ter-se efectuado uma manipulação ao nível do genoma, que dispensa os inconvenientes práticos e económicos de manter a pressão seletiva durante um processo fermentativo industrial, situação que seria necessária caso a estratégia envolvesse a inserção de um plasmídeo na levedura utilizada no processo. O Tpo1 é um transportador da superfamília MFS extensivamente estudado, que confere resistência a uma vasta gama de compostos, tais como os antimaláricos quinidina e artesunato, o imunosupressor ácido micofenólico, 2,4-D, o antibiótico bleomicina, noconazol, mancozeb, o anti-inflamatório diclofenaco e os ácidos orgânicos de cadeia pequena e média ácido acético, ácido decanóico e ácido octanóico. O Tpo1 está descrito como um transportador de poliaminas (espermina e espermidina) para o exterior da célula. Neste trabalho examinou-se a função do transportador Tpo1 na resistência ao stress induzido nas células de levedura pelo ácido benzóico, um ácido fraco muito utilizado como conservante na indústria alimentar, em alimentos acidulados. Resultados anteriores do nosso laboratório demonstraram o envolvimento do Tpo1 na resistência da levedura ao ácido benzóico. Sabe-se ainda que este transportador de membrana não está envolvido na diminuição da acumulação do ácido benzóico no interior da célula, propondo-se que, tal como foi já observado em outros transportadores MFS, o papel fisiológico do transportador de membrana Tpo1, não completamente clarificado, resulta de forma furtuita numa maior resistência ao ácido benzóico. Neste trabalho foi também estudada a regulação transcricional do gene TPO1 perante condições de stress induzido por ácido benzóico. Demonstra-se que o Tpo1 está envolvido na homeostasia de aminoácidos e, consistentemente, confirmou-se que a ativação da expressão do gene TPO1, em condições de stress causado por ácido benzóico, está dependente dos factores de transcrição Gcn4 e Stp1, dois reguladores da homeostasia de aminoácidos. Neste trabalho, foi construído um plasmídeo de fusão transcricional, em que o gene lacZ se encontra sob a regulação do promotor do gene TPO1. Recorrendo a reações de mutagénese dirigida, foram mutados individualmente os locais de ligação dos factores de transcrição Gcn4 e Stp1. Células de levedura transformadas com os diferentes plasmídeos foram sujeitas a crescimento em presença ou ausência de ácido benzoico e a ativação do promotor foi avaliada. Verificou-se que uma mutação que anule qualquer dos locais de ligação do Gcn4 ou do Stp1 diminui drasticamente a ativação da expressão. Juntamente com resultados do nosso grupo não publicados, pôde-se concluir que a ativação da expressão do gene TPO1 em condições de stress induzido por ácido benzóico depende da ligação direta e simultânea destes dois factores de transcrição no promotor.Multidrug resistance (MDR) has been described as the simultaneous acquisition of resistance to a wide range of structurally and functionally unrelated cytotoxic chemicals. Indepth knowledge in this field is determinant to struggle against negative implications of MDR in different areas such as food preservation, treatment of tumors and infectious diseases, and chemical crop protection, as well as to take advantage of positive outcomes such as the ability to tolerate chemical stress in industrial microbial cells. MDR mediated by efflux pumps is a highly conserved defense mechanism that plays an important role in yeast cells. Pdr18 is a poorly studied MDR transporter of the ATP-binding cassette (ABC) superfamily proposed to play a role in the incorporation of ergosterol in the yeast plasma membrane. PDR18 was recently identified as having a role in ethanol stress resistance. In this work, Pdr18 was found to contribute to the decrease of plasma membrane permeabilization of ethanol-stressed yeast cells. An engineered yeast strain constructed in this work, overexpressing PDR18, leads to higher ethanol concentrations attained during alcoholic fermentation. The improved fermentative performance of yeast cells over-expressing PDR18 correlates with their increased ethanol tolerance and ability to restrain plasma membrane permeabilization induced throughout high gravity fermentation. Tpo1 is a well-studied MDR transporter of the Multidrug Facilitator Superfamily (MFS) that provides resistance to a broader range of drugs and is involved in polyamine homeostasis across the plasma membrane. Its role in yeast resistance to the weak acid food preservative benzoic acid is herein examined. TPO1 expression was previously shown to increase benzoic acid resistance in Saccharomyces cerevisiae. The mechanism underlying this resistance is proposed here to rely on its physiological role rather than on the direct export of benzoic acid out of the cell. Tpo1 is also demonstrated to be involved in amino acid homeostasis. Consistently, the up-regulation of TPO1 gene under benzoic acid stress conditions is found to be dependent on the transcription factors Gcn4 and Stp1, known to control yeast response to amino acid limitation. Gcn4 and Stp1 are shown to activate directly TPO1 transcription by simultaneously binding to their binding sites on the promoter.engEtanolResistência microbiana a drogasSaccharomyces cerevisiaeTeses de mestrado - 2012master thesis