Castanho, Miguel Augusto Rico Botas, 1967-Ribeiro, Marta Maria Batista, 1985-2013-01-162013-01-162012http://hdl.handle.net/10451/7512Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2012The pharmaceutical potential of natural analgesic peptides is limited by their inability to cross the Blood-Brain barrier. Increasing peptide-cell membrane affinity through drug design is a promising strategy to increase peptides properties and enhance brain targeting. In this work, we synthesized derivatives of Kyotorphin (KTP, Tyr-Arg; KTP), an analgesic opioid-like neuropeptide unable to cross the BBB. By combining C-terminal amidation and N-terminal grafting of Ibuprofen, we obtained amidated KTP - KTP-NH2, Ibuprofen-KTP - IbKTP and Ibuprofen-KTP-NH2 - IKTP-NH2. Biophysical studies were carried out using fluorescence spectroscopic methodologies to characterize the peptides interaction with biomembrane model systems to evaluate peptide’s activity and ability to cross the BBB. Partition coefficient quantification showed a clear preference of the derivatives towards fluid zwitterionic and anionic membranes, unlike original KTP. A relationship between anionic lipid percentage and in-depth insertion in the membrane was detected. Studies with fluorescent probe di-8-ANEPPS revealed that, unlike KTP-derivatives, morphine prefers cholesterol rich membranes, which suggests distinct modes of action between them. Additionally, we used primary cultures of BBB endothelial cells and quantified for the first time to the best of our knowledge their membrane surface charge. For this, we used zeta potential dynamic light scattering. Membranes from the BBB cells are more negatively charged than umbilical vein endothelial cells, red blood cells, lymphocytes and platelets. From the KTP derivatives, IbKTP-NH2 caused the highest shift in the zeta potential, towards neutralization. Compounds’ analgesic efficacy was studied in male Wistar rats using acute and chronic pain models after systemic administration. Unlike KTP, all KTP derivatives were highly active. The strongest analgesic compound is IbKTP-NH2, effective from doses as low as 25 μmol/kg. These results, associated with a strong inhibition of pain transmission at the spinal dorsal horn, indicate the ability of these KTP derivatives to cross BBB. The preference for anionic membranes translated in antimicrobial activity against Staphylococcus aureus bacteria with amidated KTP derivatives. Atomic Force Microscopy was used and membrane blebbing, disruption and lysis as a result of peptides activity were imaged. In vivo assessment of side-effects associated with opioid drugs was performed for the peptides with most promising activities and potency: KTP-NH2 and IbKTP-NH2. In contrast to morphine and tramadol, these KTP derivatives do not trigger the major side-effects associated to opioids. Taken together, our results indicated that opioid pathways are indirectly involved in KTP mechanism of action, because a direct binding to opioid receptors is reduced and naloxone abolishes KTP analgesic efficacy. The combination of brain targeting with analgesia and antibacterial activities in the absence of toxicity and side-effects make these new KTP derivatives extremely promising compounds for future pharmaceutical development.A dor, especialmente a dor crónica, é um grave problema de saúde pública e afecta uma em cada cinco pessoas na Europa. Os analgésicos disponíveis no mercado são frequentemente inadequados e limitam-se a três classes: agonistas de opióides, anti-inflamatórios esteróides e anti-inflamatórios não esteróides (NSAIDs). A sua eficácia clínica muitas vezes limita-se a alguns tipos de dor. Adicionalmente, fenómenos de tolerância e diversos efeitos secundários estão associados ao seu consumo, o que restringe a utilização prática destes fármacos no controlo da dor. Face à enorme necessidade de novas soluções para combater a dor, os péptidos representam uma inovadora classe de compostos muito promissores. Mesmo assim, a pesquisa de novos analgésicos é um enorme desafio. A grande selectividade da barreira de células endoteliais que protege o encéfalo, Barreira Hemato-Encefálica (BBB), limita a descoberta de novas drogas cujo alvo celular se situe no Sistema Nervoso Central. Uma estratégia possível para tentar superar esta limitação é utilizar péptidos humanos endógenos e desenhar novos derivados, tentando combinar o atravessamento da BBB com a manutenção da funcionalidade. A Quiotorfina (KTP), descoberta em 1979, foi descrita como um dipéptido analgésico endógeno actuante no encéfalo. Com uma actividade analgésica cerca de 4 vezes superior a outros péptidos endógenos como a met-encefalina, este dipéptido apresenta características muito interessantes e pensa-se que actua através de mecanismos opióides. Contudo, as tentativas para a utilizar como analgésico após administração sistémica têm sido infrutíferas, dada a sua incapacidade de atravessar a BBB. Para superar esta dificuldade, conceberam-se, sintetizaram-se e estudaram-se três novos derivados da KTP. A primeira alteração estrutural consistiu numa substituição do grupo hidroxilo terminal por um grupo amida, que resultou em KTP-NH2. Esta modificação, ao aumentar a carga global do péptido, poderá melhorar a sua interacção para com membranas biológicas. A segunda alteração foi uma inovadora combinação de Quiotorfina, uma molécula com características opióides, e Ibuprofeno (Ib), um NSAID lipofilo, dando origem a dois compostos: IbKTP e IbKTP-NH2. Na prática clínica, uma combinação de mais do que um tipo de analgésico é frequentemente usada com sucesso. De facto, a complexidade das vias de lesão tecidular, inflamação, transdução de sinal e dor exige uma estratégia multi-alvos, que consiga atacar a dor nos seus múltiplos mecanismos e origens. Neste trabalho, foi adoptada uma estratégia de investigação de crescente complexidade dos modelos em estudo para caracterizar os novos derivados da KTP. Inicialmente começou-se por estudar a interacção entre estes péptidos e modelos de biomembranas. Mais do que meras barreiras celulares, há evidências científicas de que as membranas celulares desempenham importantes papeis, funcionando como catalizadores de interacção péptido-receptor, ao concentrar o péptido na membrana e induzir uma conformação propensa à ligação ao receptor. Adicionalmente, os modelos de membrana podem ser considerados uma aproximação simplista da BBB, e assim permitir uma primeira avaliação da capacidade dos novos derivados para atravessar esta barreira. Nesta parte do trabalho, foram essencialmente realizados estudos biofísicos, baseados em técnicas de espectroscopia de fluorescência, dado o facto de os péptidos serem intrinsecamente fluorescentes sem necessidade de acoplamento de sondas. Todos os derivados mostraram uma interacção melhorada para biomembranas, em comparação com o dipéptido original. O coeficiente de partição revelou uma clara preferência dos derivados para membranas fluídas zwiteriónicas e aniónicas. Uma relação entre percentagem de lípido negativo e inserção em profundidade dos péptidos na membrana foi estabelecida. O péptido IbKTP-NH2 revelou a mais extensa interacção e partição para as vesículas estudadas, tendo-se verificado que para este derivado o coeficiente de partição aumenta exponencialmente com a percentagem de lípido aniónico na membrana. Dada a ausência de emissão de fluorescência intrínseca da morfina, comparações de preferências moleculares de interacção com biomembranas foram efectuadas através de uma metodologia baseada na emissão de fluorescência da sonda di-8-ANEPPS. Esta sonda, ao ser sensível a alterações no momento dipolar da membrana, reporta ligações de péptidos através de alterações nesta propriedade. Ao contrário dos derivados da KTP, a morfina prefere domínios mais rígidos, com presença de colesterol, o que sugere mecanismos de acção distintos entre este opióide e os derivados da KTP. A interacção melhorada dos derivados da KTP para os modelos membranares poderia relacionarse com 1) uma maior capacidade de atravessamento da BBB, e/ou 2) adopção de uma conformação optimizada para ligação ao receptor e consequente aumento da actividade analgésica. A afinidade de compostos para a BBB é determinada pelas características dos compostos, nomeadamente pela sua lipofilicidade. Os novos derivados da KTP combinam características lipófilas com maior carga positiva, mas não se conhecia em que medida a carga influenciava a passagem de compostos através da BBB. Assim, para estimar a afinidade dos derivados da KTP para a BBB, utilizaram-se culturas primárias de células endotelials da BBB e quantificou-se a carga de membrana à superfície através de técnicas de dispersão de luz. Para comparação, o potencial zeta de células endoteliais do cordão umbilical, eritrócitos, plaquetas e leucócitos foi também quantificado. As células endoteliais da BBB mostraram ter uma carga de membrana à superfície significativamente mais negativa que as demais células avaliadas. Esta descoberta trouxe uma explicação para o facto de compostos catiónicos terem maior tendência a atravessar a BBB em relação a compostos neutros ou aniónicos. No caso concreto dos derivados da KTP, a IbKTP-NH2 foi o único péptido que alterou significativamente o potencial zeta das células da BBB, no sentido da neutralização. Estes resultados estão em acordo com os estudos biofísicos com modelos membranares e reforçam a ideia que a IbKTP-NH2 é o péptido com maior tendência para atravessar a BBB com sucesso. Este conjunto de dados promissores justificou a passagem para estudos in vivo, com a avaliação da actividade analgésica dos vários péptidos após uma administração sistémica. Isto permitiu fazer a prova de conceito sobre a capacidade dos compostos para atravessar a BBB, e ao mesmo tempo caracterizá-los farmacologicamente, em especial no que respeita a dosagem, curvas de dose resposta e tempos de actividade. A eficácia analgésica dos compostos foi estudada em ratos machos Wistar, utilizando modelos de dor aguda e crónica e estímulos nociceptivos térmicos, mecânicos e químicos. Ao contrário da KTP, todos os derivados da KTP mostraram ser activos após administração sistémica (intra-peritoneal, i.p. ou oral). O composto com maior efeito analgésico foi a IbKTP-NH2, com efeito anti-nocicetivo para doses a partir de 25 μmol/kg. Estes resultados, associados com uma pronunciada inibição de transmissão de dor no corno dorsal espinal, indicam que os três derivados da KTP estão aptos a atravessar a BBB. Para testar a dependência da actividade analgésica nos mecanismos de acção opióides, foi administrada naloxona, um antagonista inespecífico de receptores opióides, previamente à injecção dos péptidos. Enquanto a naloxona revelou uma inibição completa do efeito analgésico da KTP-NH2, o efeito da IbKTP-NH2 sofreu apenas uma redução da actividade. Deste modo, o efeito da KTP-NH2 é totalmente dependente de mecanismos opióides, enquanto para a IbKTP-NH2 parece haver um mecanismo duplo: dependente e independente de opióides, o que pode explicar o elevado potencial analgésico deste derivado. Perfis de interacção com modelos de membranas distintos entre a morfina e os derivados da KTP combinados com uma ligação a receptores reduzida para estes péptidos sugerem que o mecanismo de acção da KTP envolverá as vias opióides mas de um modo indirecto. Diversas actividades foram descritas para a KTP e para péptidos muito similares. Uma destas funções foi uma actividade antimicrobiana dos tripéptidos Tyr-Arg com um resíduo de aminoácido carregado positivamente, Lys ou His. Uma vez que os novos derivados da KTP apresentam maior carga catiónica e preferência de interacção com membranas aniónicas, decidiu-se testar a capacidade antimicrobiana destes péptidos contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus. Os derivados amidados, KTP-NH2 e IbKTP-NH2 provocaram a formação de vesículas, a disrupção e a lise da membrana de bactérias Staphylococcus aureus. Para além de actividade antimicrobiana, nenhum dos péptidos provocou hemólise, uma característica fundamental na perspectiva da aplicação clínica destes compostos. Estas observações foram efectuadas com microscopia de força atómica. Os derivados amidados, por reunirem actividades e eficácia mais promissoras, foram avaliados in vivo para a possibilidade de gerarem efeitos secundários. Ao contrário da morfina e do tramadol, dois fármacos utilizados na prática clínica, KTP-NH2 e IbKTP-NH2 não provocaram os principais efeitos secundários associados aos opióides, o que constitui mais uma indicação que o mecanismo de acção destes péptidos e dos opióides não coincide totalmente. Em conclusão, a combinação de atravessamento da BBB com actividades analgésicas e antibacterianas na ausência de toxicidade e efeitos secundários faz destes novos derivados da KTP compostos extremamente promissores para desenvolvimento farmacêutico.engNeuropeptídeosDorBarreira hematoencefálicaIbuprofenoBioquímicaTeses de doutoramento - 2012doctoral thesis