Gomes, AnitaSantos, Bruno SilvaSilva, Bernardo Nunes Araújo2025-01-072024http://hdl.handle.net/10400.5/96935Tese de mestrado, Investigação Biomédica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2024O desenvolvimento de células T γδ é dependente da ação de vários mecanismos moleculares, que regulam a diferenciação destas células em linhagens distintas e também as suas capacidades efetoras. Os modelos atuais de diferenciação propõem que o desenvolvimento destas células ao nível do timo seja responsável por um “pré-comprometimento” das células T γδ para um de dois programas efetores, que se distinguem pelas citocinas efetoras produzidas: um programa produtor de IFN-γ (γδIFN) e um outro de IL-17 (γδ17). Segundo este modelo, uma forte estimulação do TCR e sua subsequente sinalização levam à formação de células comprometidas ao programa γδIFN, enquanto que sinais mais fracos ou ausentes promovem o programa γδ17. Para além do desenvolvimento no timo, níveis adicionais de regulação, como a ativação ou a repressão de expressão genética através da ação de fatores epigenéticos ou de transcrição, assim como a estimulação através de sinais extracelulares, como por exemplo a sinalização mediada por citocinas ou através de recetores de superfície, são responsáveis por regular a homeostase, as respostas efetoras e a plasticidade funcional das células γδ. As células T γδ funcionam como uma linha de defesa primária a patogénios por meio de respostas mediadas por citocinas, e o controlo da produção dessas citocinas, de entre as quais se destacam IFN-γ e IL-17, é essencial para a defesa do hospedeiro e para a manutenção da homeostase. Neste trabalho, analisamos dois determinantes moleculares de sinalização do TCR descritos na literatura, CD6 e miR-181a, e o seu impacto no desenvolvimento e nas funções efetoras das células T γδ. Estas moléculas foram identificadas previamente no laboratório através de metodologias de “Next Generation Sequencing” como estando diferencialmente expressas entre os subgrupos γδIFN e γδ17, o que suscitou interesse por parte da nossa equipa em caraterizar melhor as suas funções na diferenciação de células T γδ. Na primeira parte desta tese, caracterizamos a expressão e o impacto de CD6 na proliferação e na produção de citocinas por parte de subpopulações de células T γδ. CD6 é um regulador de sinalização através do TCR pouco caraterizado em células T γδ, e as suas funções em células T convencionais são controversas, tendo sido identificado tanto como estimulador de sinalização via TCR, como repressor, ou como ambos. Com o intuito de avaliar a expressão do miR-181a nas diversas subpopulações de células T γδ, estas células foram recolhidas a partir dos timos, gânglios linfáticos e baços de ratinhos C57BL/6 e segregadas em subpopulações distintas de acordo com a expressão de marcadores de superfície caraterísticos por citometria de fluxo. De seguida, os níveis de expressão de miR-181a nas subpopulações de células T γδ foram analisados por RT-qPCR, revelando um aumento de expressão por parte deste miRNA na subpopulação γδIFN em comparação com a subpopulação γδ17. No seguimento destas observações, utilizamos um modelo de ratinho com deficiência em miR-181a/b-1 de modo a examinar se esta molécula afetaria a diferenciação de células T γδ. Comparativamente aos ratinhos WT, os ratinhos miR-181a-/- apresentam um aumento na percentagem de células γδIFN na periferia. Estes dados sugerem que o miR-181a promove o o programa γδ17 na periferia. De modo a caraterizar melhor os mecanismos por detrás do impacto do miR-181a na diferenciação das subpopulações de linfócitos T γδ, geramos uma lista abrangente de genes-alvo do miR-181a-5p. Esta lista é composta por genes-alvo expressos diferencialmente entre γδIFN e γδ17, e que adicionalmente foram previamente descritos como tendo um efeito na secreção de IFN-γ ou IL-17 por parte de células T e que participam na regulação de eventos de sinalização na sequência de estimulação do TCR. Identificamos 36 genes que correspondem aos nossos critérios, 14 dos quais apoiam nossa hipótese de que o miR-181a promove o programa efetor γδ17 por meio da modulação da força da sinalização do TCR. Esses 14 genes foram ADAM12, AHNAK, AKT3, CD53, FASL, FUT8, GPD2, ID2, IFNG, INSR, PAK1, SGMS1, TGFBR3 e THEMIS. Para examinar o impacto do miR-181a na expressão desses genes-alvo, utilizamos subpopulações de células T γδ recolhidas a partir dos gânglios linfáticos de ratinhos selvagens e de ratinhos “knockout” para miR-181a/b-1 através de citometria de fluxo, e realizamos uma análise de expressão através de RT-qPCR. Observamos que apenas três genes, FUT8, PAK1 e THEMIS, apresentavam níveis significativamente diminuídos na presença de miR-181a-5p, e apenas na subpopulação γδIFN. Inesperadamente, a expressão de AHNAK encontrava-se aumentada em ratinhos WT, mas apenas na subpopulação γδ “naïve”. Experiências adicionais serão necessárias para investigar os mecanismos moleculares através dos quais os genes-alvo podem modular a sinalização do TCR e a diferenciação nas células T γδ. Atualmente, a nossa hipótese postula que o miR-181a pode atuar de modo a potencializar eventos de sinalização mais fracos ou na ausência de estimulação de TCR, e/ou inibir a estimulação forte do TCR das células T γδ, promovendo assim a diferenciação de γδ17. Em suma, o trabalho apresentado nesta tese identifica CD6 e o miR-181a como reguladores putativos dos eventos de diferenciação e das funções efetoras das células T γδ por meio da regulação da sinalização do TCR e de vias adjacentes. Este trabalho contribui assim para a caracterização da identidade celular e fisiologia das células T γδ, gerando também novas possibilidades de modulação terapêutica.γδ T cells are unconventional lymphocytes that have been shown to play important roles in immune responses to infections and cancer. In this work, we analyze the role of two modulators of T cell receptor (TCR) signaling, CD6 and miR-181a, on the differentiation and activation of γδ T cell subsets. In the first part of this thesis, we characterize the expression and impact of CD6 on γδ T cell subset proliferation and cytokine production. Our data indicates an upregulation of CD6 expression in IFN-γ-producing (γδIFN) compared to IL-17-producing (γδ17) cells, and that CD6 promotes γδIFN proliferation in steady-state. Furthermore, CD6 mutant mice exhibited reduced susceptibility to cerebral malaria upon Plasmodium infection, consistent with a reduced IFN-γ response by γδ T cells. Our observations suggest that CD6 acts as a promoter of TCR signaling and γδIFN effector functions. In the second part of this thesis, we identify miR-181a as a putative player in TCR-mediated γδ T cell differentiation. miR-181a expression levels were upregulated in the γδIFN subpopulation when compared to γδ17 cells. Mice deficient for miR-181a/b-1 exhibited an increase in the percentage of γδIFN cells in the periphery and a decrease in γδ17 cells. Furthermore, we generated a comprehensive list of miR-181a-5p target genes differentially expressed between γδIFN and γδ17, and that play a role in IFN-γ/IL-17 programs and TCR signaling. RT-qPCR analysis of γδ T cell subsets collected from wild-type and miR-181a-/- mice revealed that three target genes, FUT8, PAK1 and THEMIS, are significantly downregulated by miR-181a-5p in the γδIFN subset, thus constituting interesting candidates for future analyses. In sum, our work identified CD6 and miR-181a as putative regulators of γδ T cell differentiation and effector functions via regulation of TCR signaling, which may open new avenues for their therapeutic modulation.engCélulas T γδDiferenciaçãoMicroRNASinalização por TCRInterferon gamaInterleucina-17Teses de mestrado - 2024master thesis203434161