Mendes, César S.Remondes, Armando Miguel Caseiro PiresBougrova, Kcénia, 1994-2019-04-102019-04-102018-07-03http://hdl.handle.net/10451/37897Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2018Movimentação coordenada é sinal de um sistema neuromuscular saudável. Contudo, este sofisticado sistema requer uma rede neuronal complexa, que é susceptível à deterioração e patologias que comprometem a locomoção. Para solucionar estes danos, primeiramente é essencial compreender como é que este sistema neuronal funciona, identificando os mecanismos, genes e circuitos responsáveis pela atividade locomotora, o que é possível através da manipulação da função neuronal. Devido à relativamente simples rede neuronal (constituída por aproximadamente 135 000 neurónios), às eficazes ferramentas genéticas e às detalhadas quantificações cinemáticas, a mosca da fruta Drosophila melanogaster é um ótimo modelo para analisar este tópico. A locomoção na mosca da fruta, tal como em qualquer outro organismo com múltiplas articulações, é altamente coordenada. Este comportamento é regulado por circuitos simples localizados na ventral nerve cord (estrutura homóloga da espinal medula em mamíferos), os geradores de padrão central, responsáveis por movimentos simples e repetitivos, sendo modulados por informação proveniente de centros superiores de controlo localizados no central brain. Esses centros são responsáveis por interpretar a informação sensorial e adaptar o padrão de locomoção consoante os desafios proporcionados pelo ambiente. De uma forma geral, estudos previamente feitos em moscas decapitadas demonstraram alguma independência da ventral nerve cord relativamente à falta de informação modulatória proporcionada pelo central brain. Essas moscas conseguiam manter uma posição estável, com as seis pernas no chão e iniciar ações de limpeza (grooming). Quando estimuladas mecanicamente, através do toque, relata-se que conseguem iniciar o andamento por alguns passos, ou mesmo voar. Contudo, essas experiências exigiam anestesiar a mosca para parar e decapitá-la, não sendo deste modo realizadas durante a locomoção. Além disso, após o corte da cabeça da mosca, podia haver libertação de neurotransmissores, o que por si pode provocar convulsões. Sendo assim, técnicas mais eficazes e observações mais detalhadas do comportamento sem o central brain ainda seriam necessárias para perceber com maior precisão que informações provindas de centros motores superiores controlam os geradores de padrão central. Uma região em específico, localizada no centro do central brain, o central complex, tem sido descrita como um centro superior de controlo motor. Esta estrutura, que pode ser relacionada com os núcleos da base ou com o cerebelo nos vertebrados, é composta por quatro subunidades: o ellipsoid body, o fan-shaped body, os noduli e a protocerebral bridge. Estas regiões foram implicadas no controlo de alguns parâmetros da locomoção, locomoção direcionada por objetivos, vários tipos de memória, sono e tomada de decisões. Além destas conclusões, as informações a nível das células e circuitos e as funções comportamentais mais detalhadas permanecem incompletas. O presente trabalho tem por objetivo analisar a função de centros superiores de controlo motor durante a locomoção livre em moscas adultas. Para este propósito, o projeto foi dividido em duas partes, uma analisando o papel geral do central brain durante a locomoção, enquanto que na segunda parte pretendia-se observar uma região em específico do central brain responsável pela locomoção, o central complex. (1) Que ordens são enviadas do central brain; (2) caso existam, que comportamentos são independentes do central brain; e (3) qual é o papel das subestruturas do central complex na modulação da locomoção. Estas foram as principais questões que este projeto teve por objetivo solucionar. Para responder a estes desafios, foram utilizadas abordagens genéticas e ensaios comportamentais. Geneticamente, foi utilizado um sistema de expressão combinatorial, permitindo inibir regiões de interesse no central brain, deixando as células na ventral nerve cord funcionais. Para a primeira parte do projeto, todo o central brain foi reversivelmente inibido com ferramentas optogenéticas – GtACR1, enquanto que para inibir o central complex as células foram hiperpolarizadas por sobre-expressão dos canais de potássio Kir2.1. Para quantificar a locomoção dessas moscas, foram utilizadas duas abordagens comportamentais. A primeira permitia observar a atividade das moscas de uma forma generalizada, a velocidade, distância percorrida e o percurso realizado. O segundo equipamento baseia-se no efeito de reflexão interna total frustrada (fTIR), em que a luz é constantemente refletida dentro do vidro sobre o qual a mosca anda livremente e, sempre que as pernas da mosca toquem no vidro, a luz é refletida e gravada pela câmara de alta velocidade. Esta abordagem permite filmar a posição das pegadas e do corpo da mosca, a 250 frames por segundo, com grande resolução espacial e temporal, facilitando a posterior quantificação da locomoção no software FlyWalker, obtendo um grande número de parâmetros, agrupados em cinco categorias principais: velocidade, parâmetros do passo, de coordenação, espaciais e de padrões de marcha. Os resultados mostram que, ao se inibir o central brain das moscas durante a locomoção, elas ainda conseguiam continuar a andar por mais alguns passos. Esta situação não se observou quando se inibiu a ventral nerve cord: as moscas pararam quase imediatamente e colapsaram, mantendo-se imóveis durante o resto da inibição optogenética. Por outro lado, durante a inibição, as moscas com o central brain a ser inibido também permaneciam imóveis ou então conseguiam executar ações de grooming de diversas partes do corpo e até mesmo em sequência. Curiosamente, algumas destas moscas também conseguiram começar a andar, contudo, esta ação não era continuada e entrava em conflito com o grooming, sendo ambos executados em simultâneo e em constante interrupção. Outro comportamento interessante observado foi de moscas que saltavam e voavam por um breve período de tempo após ligar a luz verde, que inibe os GtACR1, ou após um estímulo mecânico-sensorial durante a inibição. Acerca dos resultados relativos à segunda parte do projeto, do papel do central complex na locomoção, foram analisadas as quatro subestruturas, diferentes regiões dentro da mesma subestrutura e conjuntos associando circuitos de mais que uma subestrutura, perfazendo um total de 15 linhas de moscas analisadas. Após a quantificação, os resultados demonstraram que todas as subestruturas possuem alguma influência em parâmetros locomotores. Salienta-se a função dos noduli no controlo de cada perna individualmente; da protocerebral bridge tendo a mesma função que os noduli e, adicionalmente, o controlo de parâmetros espaciais; a região ventral do fan-shaped body apresentou ter efeitos opostos às regiões mais centrais e dorsais da mesma estrutura; a região mais interior do ellipsoid body aparenta ter um forte controlo em praticamente todos os parâmetros, com especial destaque na percepção espacial; o circuito que interliga a protocerebral bridge, o fan-shaped body e os noduli aparenta também ter uma forte influência nos parâmetros de cada passo, com um pequeno controlo espacial e dos padrões de marcha. Concluindo, os resultados demonstraram que (1) o central brain é necessário para controlar diferentes comportamentos, evitando o seu conflito, pois moscas com essa região inibida executavam grooming e tentavam iniciar a locomoção simultaneamente. Também é necessário para manter a locomoção, visto que, mesmo com as tentativas de iniciar o andamento, este era interrompido passado um curto período de tempo. Contudo, mesmo sem o comando de centros de decisão e interpretação de informação, (2) a ventral nerve cord conseguia executar ações de grooming e até iniciar a locomoção, apesar de não conseguir manter as pernas a andar em ciclo por vários passos. Adicionalmente, pode-se concluir que, dentro do central brain, (3) cada subestrutura do central complex modula pelo menos um parâmetro locomotor e diferentes regiões do ellipsoid body e do fan-shaped body têm variadas influências em diferentes parâmetros, tendo por vezes efeitos opostos. De uma forma geral, o central brain e o central complex aparentam ser essenciais para a manutenção e coordenação da locomoção, modulando as ações da ventral nerve cord e, consequentemente, controlando os diversos parâmetros de atividade motora.Coordinated movement is a sign of a healthy neuromuscular system that requires a complex neural network, which is susceptible to deterioration, hindering locomotion. To overcome this impairment, it is essential to understand how this network operates, identifying the mechanisms, genes and circuits underlying walking activity. Due to its powerful genetic tools and detailed kinematic quantification approaches, the fruit fly Drosophila melanogaster is an outstanding model to address this topic. Locomotion in the fruit fly is governed by simple circuits located in the ventral nerve cord, which are modulated by information provided from higher-order control centers in the central brain. These centers are responsible for interpreting sensorial information and accommodate the walking pattern accordingly. A specific brain region, the central complex, has been described as a higher-order motor control center. This structure, which can be related to the basal ganglia or the cerebellum in vertebrates, is composed by four subunits: ellipsoid body, fan-shaped body, noduli and protocerebral bridge. These neuropils have been shown to control some walking parameters and goal-directed locomotion, among other functions. Despite these findings, the cellular and circuit-level information and the detailed behavior functions remain incomplete. The aim of this project was to dissect the roles of the higher-order centers during locomotion of freely walking adult flies. (1) What motor commands are being provided from the central brain; (2) which behaviors, if any, are central brain-independent; and (3) what role is played by the central complex substructures to modulate locomotion. The results show that (1) the central brain is required for walking maintenance and to avoid motor conflicts. Nevertheless, (2) it is not required to perform grooming, reflexive responses and walk initiation. Moreover, (3) each substructure of the central complex modulates at least one locomotor parameter and the same substructure can have opposite effects in the same parameter.engCentral brainCentral complexLocomotionBehaviorTeses de mestrado - 2018master thesis201950502