Góis, Pedro Miguel PimentaMonteiro, Sofia Alexandra Garcia2024-03-112024-01-042023-11-30http://hdl.handle.net/10451/63341Tese de mestrado, Química Medicinal e Biofarmacêutica, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Apesar dos avanços científicos significativos e da grande variedade de tratamentos já disponíveis, o cancro continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo. A quimioterapia, que é frequentemente um dos primeiros tratamentos a ser oferecido aos pacientes, padece regularmente de baixa seletividade para as células cancerígenas, o que leva ao aparecimento de efeitos secundários. Assim, torna-se imperativo desenvolver alternativas que não danifiquem os tecidos saudáveis e que permitam que os fármacos sejam entregues de forma segura e seletiva às células cancerígenas. Uma maneira de alcançar tal objetivo consiste em utilizar as diferenças existentes entre as células saudáveis e as células normais para direcionar os fármacos para o microambiente tumoral. Comparativamente com as células normais, as células cancerígenas caracterizam-se por apresentarem elevadas concentrações de espécies reativas de oxigénio (ROS) devido ao stress oxidativo a que as mesmas estão sujeitas, resultante da perturbação da homeostase redutiva-oxidativa. Desta forma, no presente trabalho pretendeu-se desenvolver profármacos cuja ativação ocorre especificamente nas células cancerígenas, quando os mesmos entram em contacto com as ROS. Os profármacos desenhados neste trabalho são precursores de dois inibidores de histonas deacetilases (HDACi), o panobinostat e o vorinostat. Para além de sofrerem de instabilidade química e rápida eliminação metabólica, estes agentes anticancerígenos apresentam efeitos secundários e toxicidade nas células saudáveis uma vez que inibem de forma não seletiva a maioria das isoformas desta enzima. Posto isto, os profármacos concebidos poderão ser uma possibilidade para aumentar a seletividade e melhorar as propriedades dos fármacos selecionados. No desenho de profármacos responsivos às ROS, é importante ter em atenção a escolha do grupo responsável pela ativação. Tal grupo deve ser altamente reativo e selectivo para as ROS, mas deve ser estável até chegar às células cancerígenas, não sendo oxidado antecipadamente. Para além disso, não deve reagir com moléculas endógenas. Já existem diversos grupos reativos às ROS, sendo possível destacar os ácidos e ésteres borónicos como os mais utilizados até ao momento. Todavia, apesar de serem oxidados ao álcool correspondente na presença de ROS, estes dois grupos funcionais apresentam uma aplicabilidade terapêutica limitada pela falta de estabilidade que demonstraram. Diazaborinas (DABs) são heterociclos de boro e nitrogénio, e são geralmente obtidas através da reação entre hidrazinas e aldeídos ou cetonas aromáticas que possuem um ácido borónico na posição ortho. Por se terem revelado extremamente estáveis em condições biologicamente relevantes, mostrando-se simultaneamente capazes de manter uma reatividade com as ROS semelhante à dos ácidos e ésteres borónicos, estas podem ser utilizadas como alternativas a estes últimos grupos funcionais no desenho de profármacos. Assim, nos profármacos concebidos neste trabalho, a DAB vai ser a unidade capaz de responder a um estímulo (elevados níveis de ROS), para garantir a ativação do profármaco e a libertação seletiva do fármaco ativo nas células cancerígenas. De forma a ser possível obter estes heterociclos de boro e nitrogénio após reação com o ácido 2-formilfenilborónico (2-FPBA), foi necessário proceder a algumas modificações estruturais nos dois HDACi escolhidos. Essas modificações consistiram em converter o ácido hidroxâmico do vorinostat e do panobinostat numa hidrazida. Mais tarde, o análogo do vorinostat foi transformado num outro composto que possuía uma hidrazina em vez de uma hidrazida. Antes de se proceder à síntese dos análogos dos HDACi e correspondentes profármacos, foi realizado um estudo computacional através de um modelo de machine learning para se obter uma previsão da atividade inibitória dos dois análogos do vorinostat idealizados. Tal como ambicionado, os resultados obtidos neste estudo sugerem que os dois novos compostos mantêm o mesmo tipo de atividade inibitória que a pequena molécula original. Isto significa que os valores de IC50 estimados são semelhantes aos do vorinostat, não sendo esperado que estes análogos sejam seletivos para determinadas isoformas da enzima. De seguida, começaram por ser sintetizados os análogos do vorinostat e do panobinostat constituídos por uma hidrazida. Apesar de ter sido possível a obtenção de ambos os compostos, a formulação do correspondente profármaco não foi exequível. A análise dos espetros de ressonância magnética nuclear (NMR) e cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espetrometria de massa de alta resolução (HPLC-HRMS) dos produtos obtidos após a reação de cada um destes dois análogos com o 2-FPBA indicou que estas reações não foram tão eficientes como era expectável. Nesses espetros foi identificada a presença de ambos os materiais de partida, sendo que estes estavam em quantidade igual ou superior à da DAB. Tendo em conta estes resultados, pensou-se que ao contrário das hidrazinas, as hidrazidas poderiam não ser os substratos mais adequados para a formação das DABs pretendidas. Assim, posteriormente estudou-se a reação de formação da DAB com recurso ao HPLC-HRMS, utilizando a benzohidrazida e a benzilhidrazina como substratos modelos com o objetivo de tentar compreender de que forma estes poderiam influenciar o produto formado. Verificou-se que quando a reação era realizada com a benzohidrazida, rapidamente era estabelecido um equilíbrio entre os reagentes e o produto, pelo que a concentração das três espécies em solução se manteve constante ao longo do tempo. Para além disso, ao analisar-se a solução após 3 horas de reação, constatou-se que a concentração dos reagentes era superior à da DAB, o que corroborou os resultados anteriormente obtidos. Por outro lado, quando foi utilizada a benzilhidrazina, observou-se um decréscimo na concentração dos dois reagentes e, em simultâneo, um aumento na concentração da DAB ao longo do tempo. Nestas condições, a DAB foi a espécie maioritária identificada na solução após 3 horas de reação. Os resultados descritos sugerem que a formação de DABs derivadas de hidrazinas é mais favorável, tendo impulsionado a idealização de um novo análogo do vorinostat que possuía uma hidrazina em vez da hidrazida. De seguida, foi sintetizado um novo análogo do vorinostat que possuía uma hidrazina. Não obstante ter sido obtido com sucesso, vários dos passos sintéticos utilizados para a formação deste composto ainda necessitam de ser otimizados. Obtido este análogo, foi possível fazer reagir o mesmo com o 2-FPBA e isolar o correspondente profármaco com um rendimento igual a 65%. Após confirmada a obtenção da DAB, a sua estabilidade hidrolítica foi avaliada a três valores diferentes de pH (5.0, 7.5 e 9.0) através de HPLC-HRMS. Neste estudo, verificou-se que a concentração do composto se manteve praticamente inalterada ao fim de 24 horas nas três condições testadas, sendo um indicativo de que o mesmo era estável. Ainda assim, no futuro este ensaio pode ser repetido para que seja seguido durante um período superior. Por fim, a cinética de oxidação foi estudada numa solução de bicarbonato de amónia 10 mM (pH 7.4) com peróxido de hidrogénio com recurso a análises por HPLC. A oxidação do composto foi observada tanto na presença de 100 equivalentes como na presença de 10 equivalente do oxidante. Em ambas as condições, o tempo de semi-vida ("t" _("1/2, 100 eq " "H" _"2" "O" _"2" )= 1,5 horas e "t" _("1/2, 10 eq " "H" _"2" "O" _"2" ) = 4 horas) e velocidade de reação ("k" _("obs, 100 eq " "H" _"2" "O" _"2" ) = 0.008 min-1 e "k" _("obs, 10 eq " "H" _"2" "O" _"2" ) = 0.001 min-1) alcançados são compatíveis com as possíveis futuras aplicações in vivo. No entanto, esta estratégia ainda se encontra numa fase inicial, pelo que ainda são necessários mais estudos in vitro. A hidrólise da hidrazona formada após a oxidação da DAB deverá ser avaliada, para confirmar que ocorre a libertação do fármaco ativo. Para além disso, ensaios de inibição enzimática deverão ser realizados com o análogo mais recente do vorinostat nas várias isoformas da enzima, e a atividade inibitória do mesmo deverá também ser avaliada em diferentes linhas celulares cancerígenas. Por fim, o profármaco sintetizado também irá ser testado em diferentes linhas celulares cancerígenas e saudáveis, para que seja possível confirmar a seletividade e especificidade do mesmo para as células cancerígenas. Em conclusão, os resultados obtidos demonstram que o profármaco desenvolvido neste trabalho poderá vir a ser utilizado como uma nova abordagem promissora e viável para entregar seletivamente fármacos citotóxicos às células cancerígenas. Mais ainda, as DABs provaram ser estruturas com potencial de serem utilizadas como grupos protetores de hidrazinas, compostos conhecidos pela sua elevada toxicidade.Despite significant advances in science and the wide variety of available treatments, cancer remains a major cause of death worldwide. Chemotherapy, which is frequently one of the first-line treatments, suffers from low selectivity to cancer cells and limited efficacy due to the appearance of important side effects. Thus, it becomes imperative to develop a new generation of targeted alternatives that spare healthy tissues by safely and selectively delivering cytotoxic payloads to cancer cells. One way to accomplish this goal consists of designing therapeutic agents that target biological events specific to cancer cells. Given that cancer cells are characterized by high ROS concentrations, this work aimed to develop a new generation of improved ROS-responsive prodrugs. In this work, a diazaborine scaffold was chosen as the ROS-responsive unit. Diazaborines, which are aromatic B-N heterocycles, were envisioned as alternatives to boronic acids, compounds that, despite showing good reactivity and selectivity towards ROS, still display important stability shortcomings. The proposed prodrugs are precursors of HDACi, panobinostat and vorinostat. To employ the novel approach and design these prodrugs, the selected anticancer agents were structurally modified, through the replacement of the hydroxamic acid group by a hydrazide or a hydrazine. A machine learning computational study predicted that these modifications allowed the new analogues to retain similar inhibitory activity as the original molecules. The formation of hydrazine-derived diazaborines was shown to be more efficient and favorable, and it was only possible to isolate the diazaborine derived from the vorinostat analogue that possesses a hydrazine (65% yield). Once isolated, this compound proved to be stable after 24 hours at different pH values, and was oxidized in the presence of H2O2 even when only 10 equivalents of the oxidant were used (kobs = 0.001 min-1 and t1/2 = 4 hours). Altogether, this work provides preliminary results that highlight the potential of diazaborines as ROS-responsive units to design tumor-targeted prodrugs.engCancerDiazaborinesReactive oxygen speciesProdrugsTeses de mestrado - 2024master thesis203499468