Brito, Maria Alexandra de Oliveira Silva Braga Pedreira deHerrera Garcia, FedericoRodrigues, Carolina Adelaide Major2025-01-1120242024http://hdl.handle.net/10400.5/97096Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasAtualmente, o cancro da mama (CM) é um dos principais responsáveis pelo aumento do número de casos de doença oncológica, sendo a neoplasia mais diagnosticada e a principal causa de mortalidade feminina. Apesar dos avanços na taxa de sobrevivência dos pacientes com CM, o surgimento de metástases leva ao seu declínio. Exacerbando a situação, cerca de 30% dos pacientes com CM metastático desenvolvem metástases encefálicas (ME), uma condição incurável e associada a um prognóstico severo. Este prognóstico deve-se, sobretudo, à permeabilidade seletiva que a barreira hematoencefálica (BHE) apresenta, dificultando o tratamento de pacientes nesta condição. Entre os subtipos de CM, o triplo-negativo não só é um dos mais agressivos, como também é dos que apresenta uma maior incidência de ME. Estes factos, aliados à escassez de opções terapêuticas oriundas do desconhecimento de alvos moleculares específicos para este subtipo, determina o prognóstico severo e enfatiza a urgência do desenvolvimento de novas terâpeuticas. Neste sentido, modular alterações moleculares e vias de sinalização que as células tumorais exploram para a progressão do cancro é crucial para o desenvolvimento de terapias direcionadas. Vias como a ciclina D1-cinases dependentes de ciclina (CDK) 4/6 e a fosfatidilinositol-3-cinase (PI3K)/proteína cinase B (AKT)/alvo da rapamacina em mamíferos (mTOR), que promovem a progressão do CM, constituem potenciais alvos terapêuticos particularmente relevantes para o CM triplo-negativo, que apresenta alterações a elas associadas. Neste âmbito, estudos prévios realizados no nosso laboratório identificaram um inibidor promissor de ambas as vias ciclina D1-CDK4/6 e PI3K/AKT/mTOR, pelo que o objetivo deste trabalho consistiu na avaliação da sua eficácia e segurança em modelos pré-clínicos distintos: um modelo esferóide tumoral tridimensional (3D) in vitro com células de adenocarcinoma humano triplo-negativo (MDA-MB-231- Br4), o qual foi também combinado num modelo da BHE in vitro, assim como um modelo in vivo que recorre à inoculação de células de CM triplo-negativo de murino (4T1) para o desenvolvimento de ME. Por conter várias camadas com comportamentos distintos, o modelo esferóide mimetiza a complexidade tumoral e confere uma resistência terapêutica análoga à observada em respostas humanas. Por outro lado, o modelo murino escolhido para o estudo de ME do CM (MECM) facilita o desenvolvimento de metástases experimentais ao replicar com precisão a formação e a localização das MECM em locais típicos, como o hipocampo. Logo, ambos os modelos têm grande potencial para simular ME, justificando sua escolha para os estudos pré-clínicos realizados. Para o nosso trabalho começámos por estabelecer e caracterizar um modelo tumoral 3D de MECM usando as células MDA-MB-231-Br4, uma linha celular com propensão para a metastização no encéfalo. Para a monitorização diária do diâmetro e da morfologia dos esferóides foi utilizado um microscópio de fluorescência widefield, enquanto que para a monitorização da função metabólica foi medida a intensidade de fluorescência após o ensaio da resazurina. Foram testadas três densidades celulares (1000, 2000 e 5000 células/poço), para as quais se observou um crescimento dos esferóides até o quarto dia, seguido de um declínio após o sexto em cultura. A atividade metabólica dos esferóides mostrou-se crescente até ao oitavo dia, independentemente da densidade celular, sugerindo uma viabilidade sustentada. Os resultados mais promissores foram observados para a densidade de 2000 células/poço, onde as alterações morfológicas foram menos drásticas comparativamente, proporcionando melhor reprodutibilidade. O terceiro dia foi escolhido como ideal para os estudos, pois a integridade estrutural e viabilidade foram mantidas até ao quarto dia permitiriam ensaios de 24 horas (tempo escolhido para ensaios in vitro) em condições ótimas. Visando avaliar a ação do inibidor duplo previamente identificado, 10 μM deste foram aplicados em esferóides formados (com três dias, ponto ótimo) durante 24 horas e foram avaliadas as alterações estruturais e na expressão das proteínas alvo por imunocitoquímica. Usando um microscópio de fluorescência widefield, verificou-se que tanto os esferóides não tratados, como os tratados com abemaciclib (controlo positivo, inibidor CK4/6 permeável à BHE) preservaram a sua integridade estrutural, enquanto os tratados com o inibidor duplo apresentaram um índice de deformação acentuado (p<0.01). Por sua vez, a avaliação da expressão proteica através de microscopia confocal permitiu inferir que o inibidor reduz eficazmente a proliferação celular (expressão do Ki-67, p<0.001), ao contrário do abemaciclib. A redução na expressão da CDK4 (p<0.001) também foi evidente, mas o inibidor não teve efeito significativo na expressão da ciclina D1 e da CDK6, enquanto o abemaciclib provocou o seu aumento (p<0.001). Para complementar esta última avaliação, repetimos a análise com uma concentração mais elevada do inibidor (100 μM), para estudar o seu efeito na expressão das proteínas que se mantiveram inalteradas com a concentração inicialmente usada (10 µM). Observou-se que uma maior dose de inibidor aumentou a expressão da ciclina D1, embora sem significância, contrariamente ao abemaciclib, que manteve o seu aumento significativo (p<0.001). Curiosamente, houve um ligeiro aumento da expressão da CDK6 (p<0.001) por parte do inibidor duplo, enquanto o abemaciclib diminuiu acentuadamente a sua expressão (p<0.001). Estes resultados sugerem que o inibidor duplo poderá ter afinidade superior pela CDK4 em relação à CDK6, à semelhança do controlo positivo, o que explicaria a redução significativa na expressão de CDK4 com menores doses de fármaco e a mínima variação na expressão do CDK6. Dado que este trabalho visava o tratamento das MECM, avaliámos a segurança do inibidor para as células do endotélio cerebral, assim como a sua eficácia com o endotélio da BHE. Para tal, foi utilizado um modelo robusto da BHE in vitro em que células endoteliais humanas da microvasculatura cerebral (HBMECs) são cultivadas sobre membranas semi-permeáveis (transwells), colocados em poços de caixas de cultura, definindo um compartimento superior (que mimetiza o compartimento sanguíneo) e um inferior (que mimetiza o encéfalo), onde são colocados os esferóides. Após a aplicação de 100 μM de inibidor (maior concentração testada), foram medidas a resistência elétrica transendotelial e a permeabilidade paracelular das monocamadas endoteliais, não se tendo observado alterações significativas em ambos os parâmetros de integridade, confirmando a segurança do fármaco para as HBMECs. Adicionalmente, a eficácia do inibidor nos esferóides foi avaliada por imunocitoquímica e microscopia confocal, confirmando novamente a redução da proliferação celular (Ki-67, p<0.001) e da expressão da CDK4. Houve também uma redução da expressão da ciclina D1 (p<0.001), enquanto a CDK6 aumentou com o inibidor duplo (p<0.001), possivelmente por mecanismos compensatórios. Dado os resultados promissores obtidos in vitro, com células humanas, projetou-se avançar para estudos in vivo como prova de conceito. Começou por se assegurar a atividade do inibidor em células murinas (4T1) usadas no modelo in vivo, recorrendo à análise imunocitoquímica da proliferação celular. Observou-se uma redução significativa na expressão de Ki-67 (p<0.001), semelhante aos resultados com células humanas em culturas simples, o que nos permitiu avançar. O modelo murino da patologia foi estabelecido através da inoculação de células 4T1 na artéria carótida comum de ratinhos imunocompetentes, promovendo o desenvolvimento de ME. Sete dias após a injeção, quando já existem metástases bem estabelecidas, os animais foram tratados durante quatro dias por gavagem oral com 100 mg/kg de inibidor duplo ou de abemaciclib. Em contrapartida, o grupo de controlo negativo recebeu apenas o veículo e os animais foram sacrificados ao 11º dia. Para avaliar a extensão das ME após o tratamento, realizou-se uma coloração de hematoxilina-eosina (HE) em secções coronais do hipocampo cranial, onde as metástases são mais frequentes. A análise das secções revelou uma redução da carga tumoral e do número de metástases em animais tratados com ambos os inibidores, mas sem significância estatística. No entanto, o inibidor duplo reduziu significativamente estes dois parâmetros especificamente na região do hipocampo (p<0.05) comparativamente aos grupos de controlo. Adicionalmente, foi realizada a avaliação histológica nos pulmões que revelou um redução na carga tumoral e no número de metástases por parte do inibidor duplo, ainda que sem significância. Assim, os resultados histológicos evidenciam a eficácia do inibidor duplo em diferentes regiões e a sua permeabilidade à BHE. Seguidamente, efetuámos uma caracterização molecular do efeito do tratamento na proliferação e na progressão do ciclo celular das ME via imunohistoquímica, examinando as mesmas proteínas dos ensaios 3D. Verificou-se uma semelhança na ação sobre o Ki-67, a CDK4 e a ciclina D1, cuja expressão foi eficazmente reduzida (p<0.001). Em oposição ao in vitro, a CDK6 foi mais suprimida com o inibidor duplo do que com o abemaciclib (p<0.001), possivelmente devido aos diferentes regimes de tratamento. Contudo, ambos acentuam a ação antitumoral do inibidor duplo e seu efeito sobre a via da ciclina D1-CDK4/6. Avaliou-se ainda a segurança do inibidor aplicando o esquema de tratamento usado anteriormente (100 mg/kg de cada um dos inibidores por gavagem oral durante 4 dias e veículo para o grupo de controlo) em animais saudáveis. As análises bioquímicas plasmáticas não revelaram alterações nos vários marcadores bioquímicos avaliados (creatinina cinase, ureia e alanina aminotransferase), tal como os exames histológicos não revelaram toxicidade ou danos estruturais nos órgãos periféricos (pulmões, fígado, rins e coração), confirmando a segurança do inibidor duplo para o tratamento do CM triplo-negativo metastático. No seu conjunto, este trabalho lança as bases para uma abordagem terapêutica pioneira para pacientes com CM triplo-negativo metastático, principalmente aqueles afetados por ME, reduzindo a letalidade e melhorando o seu bem-estar.Breast cancer (BC) is a major contributor to the global cancer burden, standing as the most diagnosed cancer and the foremost cause of death in women, particularly in its metastatic form. Targeting pathways like cyclin D1-cyclin-dependent kinases (CDK) 4/6 and phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR), which drive BC progression, could serve as an effective therapeutic strategy. Our previous studies identified a promising inhibitor of both pathways. This project aimed to evaluate the dual inhibitor in distinct pre-clinical models: an in vitro threedimensional (3D) tumor spheroid model with human MDA-MB-231-Br4 cells [triple-negative (TN) BC] and a blood-brain barrier (BBB) in vitro model incorporating spheroids, along with an in vivo murine model of BC brain metastases (BCBM) relying on the intracarotid inoculation of murine mammary carcinoma TN 4T1 cells. By containing diverse layers with different behaviours, the spheroid model mimics the complexity of tumors and confers treatment resistance similar to human responses. Our BCBM murine model promotes BCBM formation, particularly in the hippocampus. So, both models display substantial therapeutic promise for replicating BC metastases. We observed that the inhibitor significantly reduced cell proliferation in both models. Assessment of CDK4/6 and PI3K pathway associated proteins confirmed that the inhibitor consistently affected CDK4 expression in both models. Further, in a BBB in vitro model, the inhibitor penetrated the BBB integrity while maintaining its integrity. Also, the tumor burden was reduced in the hippocampus of animals administered with this inhibitor, suggesting that it crosses the BBB also in vivo, and addressing the need for an efficient treatment of brain metastases (BM). Together, our findings emphasise the potential of inhibiting CDK4/6 and PI3K signaling pathways as a promising therapeutic approach for metastatic BC (MBC), particularly for patients encountering BM, a condition marked by poor prognostic outcomes.engMetástases encefálicas do cancro da mamaBarreira hematoencefálicaCiclina D1/cinases dependentes de ciclina 4/6Fosfatidilinositol-3-cinaseModelos pré-clínicosTeses de mestrado - 2024master thesis203880161203880161