Brites, Dora Maria Tuna de OliveiraVaz, Ana Rita MendonçaGuerra, Sofia Alexandra Vieira2025-05-202024-12-042024-10-25http://hdl.handle.net/10400.5/100827Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa complexa e multifatorial, caracterizada pela formação de placas extracelulares de beta-amilóide (Aβ) e emaranhados neurofibrilares intracelulares compostos pela proteína tau hiperfosforilada. Estas anomalias levam à morte neuronal e à perda sináptica, que se manifestam clinicamente como declínio progressivo das funções cognitivas, alterações comportamentais, perda de memória, e, em fases avançadas, disfunção motora. Esta doença afeta cerca de 50 milhões de pessoas em todo o mundo, sendo particularmente prevalente na população acima dos 65 anos. Atualmente, não existe cura para a DA, e os tratamentos disponíveis são focados em aliviar os sintomas e retardar a progressão da doença. A investigação continua a procurar compreender melhor os mecanismos subjacentes à DA, com o objetivo de desenvolver terapias mais eficazes. Um dos principais mecanismos implicados na progressão da DA é a disfunção da autofagia, um processo essencial para a manutenção da homeostasia celular através da degradação e reciclagem de componentes intracelulares danificados ou desnecessários, incluindo agregados de proteínas e organelos danificados. No contexto da DA, a autofagia encontra-se comprometida, o que contribui para a acumulação de placas de beta-amiloide (Aβ) e a formação de emaranhados neurofibrilares, marcadores patológicos clássicos da doença. Recentemente, tem-se destacado o papel dos microRNAs (miRNAs) na regulação da autofagia e na inflamação associada a doenças neurodegenerativas. Em particular, o miR-142 tem emergido como um importante regulador nestes processos, sugerindo uma potencial correlação entre a sua expressão e a patologia da DA. Este estudo teve como objetivo explorar o papel da mitofagia e a expressão de genes relacionados à autofagia num modelo celular de DA, utilizando células SH-SY5Y (SH-WT) transfetadas com a mutação sueca do gene (SH-SWE), antes e após a indução de stresse oxidativo com peróxido de hidrogénio (H₂O₂). Este modelo permite a simulação de condições patológicas da DA associadas ao envelhecimento, proporcionando uma ferramenta relevante para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à doença. A fim de avaliar a autofagia, quantificámos a expressão dos genes Beclina-1, LAMP-1 e LAMP-2, utilizando RT-qPCR, e analisámos os níveis de proteína LC3 e LAMP-1 por imunocitoquímica (ICC) e Western blotting (WB). A coloração com LysoTracker foi efetuada com a finalidade de medir a atividade lisossomal nas células. Além disso, investigámos a expressão de marcadores sinápticos, como sinaptofisina e PSD-95, e marcadores inflamatórios, incluindo IL-1β, iNOS, TNF-α, S100B, TLR2 e TLR4, de modo a compreender a resposta inflamatória no modelo da DA. Avaliámos ainda a expressão de genes relacionados com a dinâmica mitocondrial, nomeadamente FIS1, DRP1 e MFN2, uma vez que a mitofagia — a degradação de mitocôndrias danificadas ou disfuncionais — é um componente crítico na DA. Finalmente, para analisar o efeito da mutação bem como do stress induzido pelo H2O2 no nosso modelo, avaliámos marcadores de diferenciação neuronal como SOX2, OCT4, MAP2, NeuN e BCL2 nas células SH-WT e SH-SWE diferenciadas. Os nossos resultados demonstraram um aumento significativo da expressão de genes relacionados com a autofagia nas células SH-SWE, comparativamente às células SH-WT (controlo sem a mutação patológica). Em particular, LAMP-1 e LAMP-2 apresentaram níveis elevados nas células SH-SWE. LAMP-1, em especial, mostrou uma expressão significativamente maior nas células SH-SWE não tratadas com H₂O₂ (p < 0,01), e uma redução não significativa após a exposição ao stress oxidativo, sugerindo uma possível compensação da atividade lisossomal nestas células. Esta observação é corroborada pela coloração com LysoTracker, que indicou uma atividade lisossomal significativamente aumentada nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT (p < 0,001), com um efeito similarmente elevado, mas não significativo, após o tratamento com H₂O₂. A expressão de Beclin-1, um marcador crucial na iniciação da autofagia, manteve-se inalterada nas células SH-SWE sob condições basais, mas foi significativamente elevada após o tratamento com H₂O₂ (p < 0,05), indicando que o stress oxidativo pode desencadear mecanismos compensatórios de autofagia. Em contrapartida, a expressão de LC3-II e, sobretudo a razão LC3-II/LC3-I, que são indicadores da formação de autofagossomas, estavam elevadas nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT (LC3-I/LC3II, p < 0,05). Este aumento não foi adicionalmente acentuado pelo tratamento com H₂O₂, sugerindo que a autofagia já se encontra ativada nas células SH-SWE, independentemente do stress oxidativo e que, a mutação APPSwe por si só representa o principal fator para esse aumento. A coloração para LC3 por ICC e os resultados de WB também confirmaram a elevação da expressão de LC3 nas células SH-SWE. A função mitocondrial foi analisada através da coloração com MitoTracker, que revelou uma redução significativa da intensidade mitocondrial nas células SH-SWE (p < 0,0001), refletindo um possível aumento da mitofagia bem como uma disfunção mitocondrial associada à DA. Este efeito foi ainda mais exacerbado nas células SH-SWE tratadas com H₂O₂ (p < 0,0001), sugerindo que o stress oxidativo agrava a disfunção mitocondrial, potencialmente através da indução de mitofagia. Além disso, os marcadores de fissão mitocondrial, FIS1 e DRP1, estavam sobreexpressos nas células SH-SWE (p < 0,001 e p < 0,05, respetivamente), e o tratamento com H₂O₂ intensificou ainda mais essa expressão em FIS1, apontando para um aumento na fragmentação mitocondrial. A redução significativa da expressão de MFN-2, um marcador de fusão mitocondrial, nas células SH-SWE (p < 0,05), agravada pelo tratamento com H₂O₂, apoia a hipótese de um desequilíbrio entre os processos de fusão e fissão mitocondrial, que pode contribuir para a disfunção mitocondrial e neuronal observadas na DA. Em termos de transmissão sináptica, verificámos especialmente uma redução significativa na expressão génica da proteína pré-sináptica sinaptofisina nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT (p < 0,001), havendo agravamento pela indução de stress oxidativo moderado (p < 0,05). Relativamente à expressão génica da proteína de densidade pós sináptica 95 (PSD-95), houve uma tendência de redução com o stress oxidativo, embora esta não tenha sido estatisticamente significativa. A análise dos marcadores inflamatórios revelou um aumento acentuado na expressão de iNOS, TNF-α e S100B nas SH-SWE (p < 0,01, p < 0,001 e p < 0,05 vs. SH-WT, respetivamente). O tratamento com H₂O₂ também contribuiu para o aumento destes marcadores, tanto em células SH-WT quanto em SH-SWE. Estes resultados indicam que a mutação sueca do gene APP695 sensibiliza as células SH-SWE para respostas inflamatórias e que o stress oxidativo exacerba ainda mais estas respostas, possivelmente contribuindo para a neurodegeneração progressiva observada na DA. A expressão de IL-1β, embora aumentada após o tratamento com H₂O₂, não alcançou significância estatística, sugerindo que outros marcadores inflamatórios podem ter um papel mais central na resposta inflamatória neste modelo de DA. Relativamente à diferenciação neuronal, verificámos que as células SH-SWE exibiram uma redução significativa na expressão de genes relacionados com a maturação neuronal, como MAP2 e NeuN, quando comparadas com as células SH-WT (p < 0,01 e p < 0,05, respetivamente). Esta diminuição foi ainda mais acentuada após o tratamento com H₂O₂, indicando que a mutação APPSwe, juntamente com o stress oxidativo, compromete a maturação e diferenciação neuronais e pode predispor as células à degeneração. Por outro lado, a expressão de genes associados à auto-renovação, como SOX2 e OCT4, aumentou ligeiramente nas células SH-SWE em comparação com as células SH-WT, com o H₂O₂ a induzir um aumento significativo na expressão de OCT4 (p < 0,01). Este aumento pode refletir uma tentativa de manter a capacidade de auto-renovação celular sob condições de stress, o que pode, paradoxalmente, comprometer a diferenciação neuronal adequada. Finalmente, a análise dos miRNAs revelou padrões distintos de expressão para miR-142-3p e miR-142-5p. O miR-142-3p estava significativamente sobreexpresso nas células SH-SWE (p < 0,001), o que sugere o seu envolvimento na regulação de genes relacionados com a autofagia, como LC3 e LAMP-1, e na promoção da mitofagia nestas células. Em contraste, o miR-142-5p mostrou um aumento significativo apenas após a indução de stress oxidativo nas células SH-SWE (p < 0,05), sugerindo que esta isoforma do miR-142 pode estar mais diretamente envolvida na regulação de processos inflamatórios e apoptóticos. Estes resultados destacam o potencial destes miRNAs como alvos terapêuticos promissores na DA.Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive decline in cognitive functions, including memory, reasoning, and daily activities. Despite extensive research, effective treatments remain elusive. Autophagy, the cellular process responsible for degrading and recycling misfolded proteins, is significantly dysregulated in AD, particularly in the aging brain, leading to the accumulation of misfolded proteins and cellular debris. Recent studies highlight the role of miR-142, particularly miR-142-3p, in modulating autophagy and inflammation. Here, we quantified gene expression levels of autophagy markers (Beclin-1, LAMP-1, LAMP-2) using RT-qPCR and measured protein levels of LC3 and LAMP-1 through immunocytochemistry and Western blotting. Additionally, we evaluated synaptic markers (synaptophysin, PSD-95), inflammatory markers (IL-1β, iNOS, TNF-α, S100B, TLR2 and TLR4), and mitochondrial dynamics markers (FIS1, DRP1, MFN2). We also assessed SOX2, OCT4, MAP2, NeuN, and BCL2 effect in differentiated SH-WT and SH-SWE cells. The expression levels of miR-142 isoforms (miR-142-3p and miR-142-5p) were also determined. Results indicated heightened lysosomal activity in SH-SWE cells vs. SH-WT, evidenced by increased LysoTracker and elevated LAMP-1 and LAMP-2 expression, despite decreased LAMP-1 levels post-H₂O₂ treatment. Beclin-1 and LC3 were elevated, suggesting enhanced autophagy, though oxidative stress compromised autophagic flux. Mitochondrial dynamics were disrupted, with decreased MitoTracker levels and increased FIS1 and DRP1 levels alongside downregulated MFN2. Furthermore, SH-SWE showed increased pro-inflammatory responses, marked by elevated S100B, TNF-α, iNOS and TLR2 levels. OCT4 levels were decreased either in the absence or presence of H2O2 in SH-SWE cells, alongside decreased levels of MAP2 and NeuN. Differential expressions of miR-142 isoforms revealed that miR-142-3p was upregulated in SH-SWE cells VS. SH-WT, correlating with enhanced autophagy, while miR-142-5p increased in response to inflammation and apoptosis pathways. Our findings highlight the complex interplay between autophagy, mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neuroinflammation in AD, suggesting miR-142 isoforms as potential therapeutic targets.engAlzheimer’s disease (AD)AutophagymiR-142Neuronal aging modelHydrogen peroxideAPPSwe transfected SH-SY5Y cellsTeses de Mestrado -2024master thesis203807243