Matos, Paulo Henrique Carrasquinho deJordan, PeterPereira, Mariana Ferreira Lírio2024-04-0220242023http://hdl.handle.net/10451/63887Tese de Mestrado, Bioquímica e Biomedicina, 2024, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasO gene CFTR (cystic transmenbrane conductance regulator) codifica um canal de cloreto e bicarbonato, presente na membrana apical de células epiteliais. A abundância e função desta glicoproteína é fisiologicamente determinante. Além de promover o equilíbrio iónico nas secreções epiteliais, é essencial para a eliminação de agentes patogénicos, proteção epitelial contra xenobióticos e produtos tóxicos libertados por agentes patogénicos, regulação do pH luminal e pela manutenção da hidratação da superfície epitelial. Deficiências na sua função, causadas por mutações no gene CFTR, estão na base do desenvolvimento da doença autossómica recessiva fibrose quística (CF). Contudo, o défice funcional de CFTR também pode ser adquirido num contexto genético selvagem, pela ação de fatores externos, como a exposição ao fumo do tabaco, álcool, metais pesados, hipoxia e acidose locais, toxinas bacterianas, stress oxidativo e inflamação capazes de comprometer a função ou abundância do canal na superfície celular e promover o desenvolvimento de doenças como a doença pulmonar obstrutiva crónica (COPD), asma, pancreatite aguda e a cólera. Esta glicoproteína é constituída por dois domínios transmembranares (TMD1 e TMD2), dois domínios citoplasmáticos de ligação a nucleótidos (NBD1 e NBD2) e um domínio regulatório central (domínio R). A sua atividade é regulada pela fosforilação do domínio R, que induz a ligação de ATP aos domínios NBD, promovendo a abertura do canal iónico. A síntese da proteína CFTR envolve a translocação da cadeia polipeptídica, proveniente do ribossoma, através da membrana do retículo endoplasmático (ER). Quando esta se encontra no lúmen do ER sofre uma N-glicosilação, que distingue a sua forma imatura com ~150 kDa, designada banda B, em ensaios de Western blot (WB). A CFTR segue o caminho da via secretora desde o ER até ao complexo de Golgi, onde é processada por várias glicosiltransferases (GTFs) de forma a atingir a sua forma madura, com 170-180 kDa, identificada como banda C. Ao atingir a forma madura é armazenada em vesiculas trans-Golgi que promovem a inserção do canal na membrana plasmática (PM). A deslocação destas vesiculas até à PM ocorre através das fibras do citoesqueleto de actina e é facilitada pela miosina Vb (Myo5b), que é recrutada pela GTPase, Rab11. Este transporte até à PM requer a ligação do domínio C-terminal da CFTR com o domínio PDZ da proteína adaptadora NHERF-1 formando um complexo. Quando este complexo é inserido na PM, a adaptadora NHERF-1 interage com a proteína de ancoragem ao citoesqueleto, ezrina, que permite a retenção da CFTR na superfície celular, impedindo a sua endocitose. A endocitose e consequente remoção da CFTR da PM é mediada pela proteína clatrina, e é desencadeada após dissociação do complexo CFTR/NHERF1/ezrina. Sabia-se que a sinalização a jusante da via de proteínas cinase mitogénicas (MAPK) estava envolvida no processo de internalização da CFTR, no entanto, os mecanismos regulatórios que promovem a remoção desta proteína da PM não estavam claros. Em estudos anteriores, o laboratório de acolhimento descreveu um mecanismo em que a quantidade e prevalência de CFTR na PM de células epiteliais brônquicas é regulada através da via de sinalização SYK/SHC-1. Este mecanismo é desencadeado pela fosforilação da CFTR, ancorada na PM, no resíduo de tirosina 512 (Y512), pela tirosina cinase citoplasmática SYK. A fosforilação da CFTR permite o recrutamento e ligação da proteína adaptadora citosólica SHC-1, através do domínio PTB desta última. A proteína SHC-1 possui também um domínio SH2 que a direciona a interagir com recetores fosforilados na PM. Ao interagir com os recetores na PM, a SHC-1 recruta outras proteínas adaptadoras citoplasmáticas, como proteínas da família GRB, e fatores de troca de nucleótidos de guanina (GEFs) da família SOS, por exemplo. Estes GEFs ativam GTPases da família RAS na PM que, por sua vez, ativam cascatas de sinalização, como a via MAPK. Assim, a proteína SHC-1 funciona como um ponto de ligação entre o sinal para a internalização, fornecido pela fosforilação da CFTR pela SYK, e a maquinaria a jusante da via MAPK que promove a remoção do canal da PM, via endocitose mediada pela clatrina. Recentemente, um grupo de investigação da Universidade de Davis (Califórnia, EUA), com o qual o laboratório de acolhimento tem uma colaboração, determinou que o fármaco idebenone (IDE), bem como alguns compostos seus derivados, conseguiam bloquear a interação da SHC-1 com o recetor da insulina (IR) em hepatócitos, interação esta também mediada pelo domínio PTB da SHC-1. Com base nestes dados, postulámos que talvez fosse possível utilizar estes compostos para interferir com a interação da SHC-1 (via domínio PTB) com a CFTR fosforilada pela SYK no resíduo Y512, impedindo assim a sua internalização em células epiteliais brônquicas. Nos estudos em hepatócitos, o tratamento com IDE inibia também a sinalização da via MAPK a jusante do IR, o que a verificar-se nas células epiteliais brônquicas poderia também contribuir para reduzir a internalização da CFTR fosforilada. No entanto, é sabido que esta via de sinalização desempenha um papel fundamental no processo de renovação celular necessário à manutenção da integridade e função do epitélio respiratório. Assim, quisemos também avaliar o grau de compromisso da viabilidade celular que o tratamento com estes fármacos acarretaria. Deste modo, o principal objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia dos inibidores recentemente desenvolvidos para a proteína adaptadora SHC-1 na modulação da prevalência de CFTR na PM. Além disso, procurámos compreender o impacto destes inibidores na via de sinalização das MAPK e na viabilidade das células epiteliais. A hipótese central deste estudo postula que os inibidores da SHC-1, nomeadamente o IDE e seus derivados, poderiam modular seletivamente a interação SHC-1/pY512- CFTR e consequentemente reduzir a internalização da CFTR na PM sem comprometer a viabilidade celular. Começámos por avaliar a capacidade dos inibidores, IDE e composto C#3, em elevar os níveis de CFTR na PM através da técnica de biotinilação, que permitiu a marcação seletiva da proteína CFTR presente na superfície celular com uma molécula de biotina após o tratamento com os inibidores, e posteriormente, a sua extração com streptavidin e análise através de WB. Os níveis de fosforilação da proteína ERK (p-ERK) também foram analisados por WB após tratamento com os inibidores, uma vez que são um indicador chave da ativação da via de sinalização MAPK. Seguidamente, realizámos ensaios de MTT para analisar a viabilidade celular nas três linhas celulares em estudo. Ao avaliar a presença de CFTR na membrana verificámos que nas três linhas celulares que utilizámos como modelos experimentais, CFBE-CFTR, 16HBE e Caco-2, nenhum dos inibidores, IDE e composto C#3, conseguiram bloquear de forma seletiva e significativa a internalização do canal. Este resultado sugere que o efeito do IDE pode ser somente específico para a interação entre a SHC-1 e o domínio NPEY fosforilado do IR, não afetando a interação da SHC-1 com outras proteínas fosforiladas, como a CFTR. Um outro resultado que apoia a especificidade dos inibidores para a interação SHC-1/IR e a incapacidade de modular a via de sinalização das MAPK, é a ausência de efeito significativo de ambos os inibidores nos níveis de p-ERK. A incapacidade de ambos os inibidores em modular eficazmente a via de sinalização das MAPK é ainda destacada pelo impacto reduzido na viabilidade das três linhas celulares em estudo, revelado pelo MTT. Notavelmente, o tratamento com IDE à concentração de 10 µM induziu uma redução significativa na viabilidade às 24 h especificamente nas células CFBE-CFTR, o que não foi replicado pelo composto C#3 em nenhuma concentração ou tempo. A comparação deste efeito com o do selumetinib e com os níveis de p-ERK1/2, sugere uma especificidade desta linha celular e da dose, possivelmente resultante do processo clonal de seleção, para o efeito do IDE. Além disso, nas células 16HBE, o composto C#3 pareceu aumentar ligeiramente os níveis de p-ERK nas concentrações mais baixas do fármaco. Esta observação está de acordo com a literatura, que sugere que as respostas ao tratamento com IDE e os seus derivados podem variar em diferentes contextos celulares. Em suma, o conjunto dos nossos resultados não apoiam a nossa hipótese inicial, levantando questões sobre a adequação do IDE e do composto C#3 como inibidores da SHC-1 fora do contexto da interação SHC-1/IR nos hepatócitos. Uma perspetiva futura seria desenvolver uma metodologia de triagem semelhante à utilizada por Tomilov et al. (2018), utilizando péptidos específicos para CFTR para revelar compostos capazes de interferir seletivamente com a interação SHC-1/pY512-CFTR, e consequentemente promover o aumento da prevalência do canal na PM. Esta abordagem permitiria ainda compreender os possíveis efeitos destes compostos no tratamento de doenças, em que tanto a função da CFTR como a via de sinalização MAPK estão desreguladas, e minimizá-los, permitindo o desenvolvimento de terapias mais específicas e eficazes.The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene encodes a chloride and bicarbonate channel crucial for maintaining ionic balance in the plasma membrane (PM) of epithelial cells. CFTR deficiency hinders the ion balance and, consequently the properties of epithelial secretions in the lung, pancreas, and colon. Its deficiency can result from genetic mutations, causing the hereditary disease cystic fibrosis (CF), or be induced, in a wild type CFTR background, by external factors such as tobacco smoke, oxidative stress and inflammation, contributing to the etiology of diseases such as asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Previously, the host lab characterized a mechanism by which CFTR phosphorylation on Y512 by spleen tyrosine kinase (SYK) triggers its internalization from the PM. The group identified SHC-1, an intracellular adaptor protein regulating mitogenic protein kinase (MAPK) signaling cascades, as a key mediator of pY512-CFTR internalization. Recently, idebenone (IDE) and its derivative compound C#3, were described to block MAPK signaling by interfering with SHC-1 interaction with phosphorylated insulin receptor (IR) in hepatocytes. In this thesis, we investigated if these compounds could be used to block SHC-1/pY512-CFTR interaction and prevent the channel’s internalization. We found that in contrast to RNAi-mediated SHC1 depletion, treatment with these inhibitors did not selectively nor significantly block CFTR internalization in three different epithelial cell lines, CFBE-CFTR, 16HBE and Caco-2. Furthermore, both inhibitors failed to significantly reduce MAPK pathway activity or consistently affect the viability of any of the three cell lines studied. This indicates that the inhibitors’ effects are specific for the SHC1/IR interaction and cannot be used to block other SHC-1 interactions, namely the SHC-1/pY512-CFTR or SHC-1/MAPK in cells other than hepatocytes. Further studies will be required to identify molecules specifically interfering with the SHC-1/pY512-CFTR interaction, allowing the development of new therapeutic options for diseases like COPD and asthma.engCFTRVia das MAPKSHC-1IdebenoneEndocitoseTeses de mestrado - 2024master thesis203606493