Cunha, Mónica Sofia VieiraPinto, Daniela Sofia MarquesAfonso, Inês Alves Medeiros Nuno2025-01-2120252024http://hdl.handle.net/10400.5/97481Tese de Mestrado, Microbiologia Aplicada, 2025, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA (re)emergência e disseminação de agentes infeciosos, incluindo agentes zoonóticos, são influenciadas pelo crescimento demográfico, globalização, alterações climáticas, mudanças no uso do solo, práticas agrícolas, destruição de habitats, entre outros fatores. As zoonoses estão associadas a uma maior interação entre humanos e animais, com ênfase nas espécies associadas à produção de alimentos, têxteis e calçado, animais de companhia e espécies exóticas comercializadas globalmente. Essas interações acarretam o potencial de disseminação de vírus e bactérias nas interfaces de contacto entre o Homem e os animais, com riscos para a saúde pública. Por outro lado, o aumento da resistência a antimicrobianos (RAM) tornou-se um problema de saúde pública global, sendo a resistência bacteriana a antimicrobianos responsável, anualmente, só na Europa, por centenas de milhares de infeções e pela morte de dezenas de milhares de pessoas, resultando em custos anuais estimados em mais de mil milhões de euros. A utilização intensiva e, frequentemente indiscriminada, de antimicrobianos em setores como a medicina humana, produção animal, agricultura e medicina veterinária é a principal causa da disseminação de RAM. O aumento da circulação de bactérias resistentes a antimicrobianos deve-se também aos crescentes contactos entre humanos e animais, impulsionados pela intensificação da produção animal para satisfazer a demanda proteica de uma população humana em expansão. Animais de produção, tais como bovinos, suínos e aves, são reservatórios de bactérias comensais com potencial zoonótico e de disseminação entre populações animais. Por outro lado, os animais selvagens estão expostos a contaminantes com origem antropogénica, nomeadamente resíduos de antimicrobianos e bactérias resistentes, contribuindo para a perpetuação de RAM nos ecossistemas. A interação entre animais de produção e animais selvagens é facilitada pela invasão crescente de áreas naturais e escassez de recursos, levando os animais selvagens a procurar alimento nas áreas de exploração agrícola e produção animal, potenciando ciclos de disseminação de agentes patogénicos e microrganismos resistentes. A transmissão inter-específica de determinantes de RAM entre diferentes populações animais também compromete a eficácia dos antimicrobianos usados em saúde humana e saúde animal. Neste contexto, o estudo desenvolvido nesta dissertação visou investigar a disseminação de Staphylococcus aureus, uma bactéria comensal oportunista com impacto em saúde pública e saúde animal, na interface entre animais de produção e animais selvagens. O objetivo foi compreender a epidemiologia das bactérias que colonizam a nasofaringe destes animais e estabelecer relações com as linhagens que circulam em diferentes espécies, incluindo as de relevância clínica no Homem. Pretendeuse também gerar informação fenotípica e genotípica que permita melhor conhecer os determinantes de resistência e virulência albergados pelas estirpes de S. aureus que colonizam estas populações e o seu potencial de disseminação através de elementos genéticos móveis. No âmbito dos vários objetivos estabelecidos, realizou-se a monitorização ativa de comunidades multi-hospedeiro em vários municípios de Portugal continental, com amostragem extensa de bovinos, javalis, e veados. A amostragem incluiu 348 amostras, entre bovinos de diferentes raças (Barrosã, Minhota, Mertolenga, Limousine, cruzados de Limousine, Frísia, cruzados de Aberdeen-Angus, cruzados de Wagyu) (n = 256), javalis (n = 57), veados (n = 23), gamo (n = 1), raposa (n = 1) e amostras ambientais (n = 10). As amostras de bovinos foram recolhidas de 11 explorações no Norte, Centro e Sul de Portugal, enquanto as de animais selvagens representaram oito zonas de caça das mesmas regiões. Após o processamento e isolamento em meio seletivo, os isolados presuntivos de S. aureus foram submetidos a testes de identificação molecular baseados na amplificação de genes específicos, incluindo o gene spa e genes que conferem resistência e virulência. Os testes de suscetibilidade a antimicrobianos seguiram um painel recomendado internacionalmente para estirpes de S. aureus. A tipificação da região spa foi realizada através da amplificação da região spa dos isolados, seguida de sequenciação por Sanger e análise bioinformática. Realizou-se a sequenciação completa dos genomas de 70 isolados, selecionados com base na diversidade intra-hospedeiro, fenótipos de resistência e perfil spa. A análise dos genomas focou-se na caracterização do resistoma, viruloma, plasmidoma, assim como na genotipagem e definição das relações filogenéticas entre os isolados gerados neste estudo, isolados caracterizados anteriormente pelo nosso grupo de investigação, e isolados cujos genomas se encontravam depositados nas bases de dados públicas. Detetou-se a colonização por S. aureus em bovinos (19,1 %), javalis (10,5 %) e veados (21,7 %), não ocorrendo isolamento em amostras ambientais, raposa ou gamo. Não se detetou resistência à meticilina e apenas três isolados exibiram resistência fenotípica a antimicrobianos, de acordo com os critérios do EUCAST: dois isolados resistentes à benzilpenicilina (obtidos de bovino e veado) e um resistente à tetraciclina (obtido de javali). A tipificação da região hipervariável spa específica de S. aureus foi realizada em 121 isolados, selecionados pela diversidade do tamanho do amplicão spa dentro da mesma amostra. A diversidade de perfis spa foi associada à diversidade de hospedeiros, evidenciando a disseminação inter-específica de alguns perfis (t267, t3750, e t11502). Alguns perfis spa foram mais comuns em regiões específicas, indicando padrões de disseminação local, nomeadamente na região do Alentejo, em bovinos (t098, t521, t359 e t267). A análise bioinformática dos 70 genomas gerados de novo neste trabalho incluiu a genotipagem in silico por Multilocus Sequence Typing (MLST) e a confirmação in silico do perfil spa. A caracterização dos perfis alélicos (ST) revelou diversidade molecular associada a diferentes hospedeiros, com a concordância entre o perfil spa e o perfil alélico. A deteção de isolados em animais de produção com perfis alélicos reportados em humanos (ST1, ST6832, ST6 e ST72) é particularmente relevante, sugerindo origem humana. Os perfis ST1, ST6832 e ST352 (este último associado à colonização em bovinos) foram predominantes nos bovinos caracterizados. Em isolados de animais selvagens, foi também possível identificar perfis alélicos associados à colonização em humanos, tais como ST1 e ST5. Nas populações domésticas e selvagens, detetou-se ST425, ST133 e ST2328, os quais têm sido reportados em múltiplas espécies. O perfil alélico ST2678, anteriormente reportado em Portugal em animais selvagens, foi também detetado neste trabalho em animais selvagens e, pela primeira vez, num bovino. Em animais selvagens, o perfil mais prevalente foi o ST2678 (33,4 %, n = 4), representado pelos perfis spa t11502 e t11232, seguido do ST425 (16,7 %, n = 2), representado pelo perfil spa t11228. Os perfis alélicos ST1 (t127), ST2328 (t3750), ST133 (t3583), ST5 (t002), ST352 (t267) e ST3223 (t14312) foram detetados em 8,62 % dos isolados dos animais selvagens. Em bovinos, o perfil predominante foi ST352 (t521, t224, t18414, t359 e t267), incluindo 36,1 % dos isolados (n = 21), seguido por ST6832 (t098) com 32,7 % (n = 19), e ST425 (t11225), ST1 (t2207 e t098) e ST6 (t701), todos com 8,62 % (n = 5), e os perfis ST2328 (t3750), ST72 (t13998) e ST2678 (t11502), que representam 1,72 % (n = 1) cada. A análise filogenética baseada na acumulação de polimorfismos de nucleótido único à escala do genoma e cgMLST (core genome MLST) revelou a proximidade genética entre os isolados deste estudo, bem como com isolados de outros estudos, reforçando as hipóteses de adaptação de S. aureus a vários hospedeiros e a disseminação de alguns clones entre animais selvagens e animais de produção, e entre regiões. A proximidade filogenética identificada entre isolados de animais pertencentes à mesma exploração de bovinos sugere disseminação local dentro da mesma exploração, mesmo entre animais produzidos em regime extensivo. A identificação, pela primeira vez, de perfis genotípicos associados a animais selvagens em bovinos sugere a disseminação na interface bovinos-animais selvagens e em diferentes escalas espaciais. A análise do resistoma permitiu identificar genes de RAM, tanto em isolados fenotipicamente resistentes, como em isolados suscetíveis, nomeadamente determinantes de bombas de efluxo de antimicrobianos (mepA, lmrS, tet.38), penicilinases (operão bla) e transferases (fosB), assim como mutações pontuais em genes que codificam transportadores e alvos da fosfomicina (GlpT e MurA, respetivamente). A identificação de genes de RAM em isolados fenotipicamente suscetíveis sugere a regulação transcricional e pós-transcricional destes genes em condições específicas. A análise do viruloma detetou genes de virulência de diferentes classes, nomeadamente aureolisinas (identificados em todos os isolados), proteases serínicas, leucotoxinas, genes que codificam proteínas associadas à produção de biofilmes, adesinas específicas para colagénio e toxinas estafilocócicas. Também foi possível identificar elementos genéticos móveis, pela análise do plasmidoma. Os replicões identificados neste trabalho têm sido associados à colonização em humanos (rep7c), enquanto outros estão associados a RAM (repUS5 and rep21). A análise permitiu ainda detetar o operão bla no repUS5 identificado no isolado resistente à benzilpenicilina proveniente de um veado. A diversidade de padrões do resistoma e do viruloma foi limitada entre isolados pertencentes ao mesmo perfil alélico, indicando assim a conservação de determinantes dentro do mesmo perfil genotípico. Este estudo demonstrou que, embora a prevalência de colonização de bovinos e ungulados selvagens em Portugal por S. aureus possa ser considerada baixa a moderada, os isolados têm potencial para expressar e disseminar determinantes de resistência e virulência, o que reforça a importância da monitorização regular de RAM nos animais selvagens, animais de produção, humanos e o ambiente, na perspetiva de Uma Só Saúde, tendo em vista a prevenção e a mitigação efetivas da transmissão de RAM e para garantir a eficácia de antimicrobianos clinicamente relevantes.Staphylococcus aureus is a pathobiont of humans and animals, representing a significant global health burden. Recent studies evidence strain exchange between humans and livestock, but knowledge of colonization and transmission dynamics at the livestock-wildlife interface lag behind. This dissertation aimed to investigate molecular diversity and antimicrobial resistance (AMR) of S. aureus at the wildlife-livestock interface in Portugal. S. aureus was isolated from the nasopharynx of cattle (n = 49), wild boar (n = 6), and red deer (n = 5) among 338 sampled animals (17.8 %). Multilocus Sequence Typing (MLST) and spa-typing of selected isolates indicated predominance of ST352 (multiple spa types) in cattle, followed by ST6832 (spa type t098), typically found in humans along with ST1, ST6, and ST72 strains, suggesting a human origin. The ST1 and ST5 alellic profiles associated with human epidemics were also retrieved from wildlife, although ST2678 and ST425 prevailed. Genome-scale typing of SNPs and cgMLST showed phylogenetic relatedness of isolates within and between herds, suggesting host adaptation and dissemination of specific clones. Transmission of S. aureus between wildlife and livestock was likely, possibly driven by interactions at shared interfaces. The integration of S. aureus genomes from wildlife sampled four years ago revealed potential dissemination of certain clones (ST72, ST2678) across Portugal. While antimicrobial susceptibility testing against a panel of 13 antimicrobials evidenced phenotypic resistance was rare, resistome analysis of selected S. aureus genomes revealed genotypic resistance in both resistant and susceptible isolates, including determinants of multidrug efflux pumps, enzymatic resistance (e.g. penicillinases), and point mutations conferring fosfomycin resistance. Analysis of the virulome retrieved aureolysins, adhesins, serine proteases, leukotoxins, adhesion-related proteins and staphylococcal toxins. Plasmidome analysis revealed plasmids associated with AMR and human colonization. Altogether, our findings suggest that the eco-evo-epidemiology of S. aureus should be investigated under the One Health paradigm to inform multiscale interventions.engStaphylococcus aureusInterface animais de produção-animais selvagensSequenciação completa do genomaResistência a antimicrobianosUma Só SaúdeTeses de mestrado - 2025master thesis